【摘要】：目的黑色素瘤是惡性程度最高的皮膚腫瘤之一,占據(jù)皮膚癌死亡率的80%。隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,免疫系統(tǒng)所發(fā)揮的作用和機制的了解,免疫療法在黑色素瘤的治療中備受關(guān)注,目前也已經(jīng)取得了一定的進展。由于黑色素瘤能夠表達特異性的抗原,因此利用黑色素瘤抗原制備腫瘤疫苗用于黑色素瘤的治療被認為是一種具有潛力的治療黑色素瘤免疫方法。DC腫瘤疫苗是指通過體外分離DC,荷載腫瘤抗原,并進行相應(yīng)處理增強其免疫刺激能力,回輸至患者體內(nèi),通過激發(fā)腫瘤特異性免疫反應(yīng)進行腫瘤治療的一類腫瘤疫苗。在DC腫瘤疫苗制備中,在荷載腫瘤抗原的基礎(chǔ)上,輔以佐劑處理DC腫瘤疫苗,能夠有效地促進DC的成熟,改善疫苗的治療效果。因而,篩選可用于DC疫苗制備的有效佐劑是DC疫苗制備中的關(guān)鍵問題�；赥LR激動劑具有促進DC成熟的作用,其常被用作制備DC腫瘤疫苗的佐劑。近來,一個新型的TLR激動劑HP-NAP,在刺激免疫應(yīng)答及抗腫瘤中的作用受到廣泛關(guān)注。在本工作中,我們利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達了HP-NAP,并進一步對其促進DC成熟,作為抗黑色素瘤DC疫苗佐劑的潛力進行了研究。以期獲得一種有效地用于制備抗黑色素瘤DC疫苗的佐劑。方法1.利用實驗室前期保存的p ET28a-His-NAP-E.coli BL21(DE3)菌株誘導(dǎo)表達HP-NAP,經(jīng)親和層析法純化得到純HP-NAP蛋白,去除內(nèi)毒素后保存于-80℃冰箱備用。2.取C57BL/6小鼠骨髓細胞,經(jīng)GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)分化得到DC。3.以不同濃度的HP-NAP,對C57BL/6小鼠來源的DC進行刺激。流式細胞術(shù)對DC表面共刺激分子CD80、CD86的表達進行檢測;熒光定量PCR法測定細胞因子IL-12、IL-1β在m RNA水平表達的變化。確定HP-NAP發(fā)揮作用的最適濃度。4.分別對野生型和TLR2缺陷型C57BL/6小鼠來源的DC給以相同濃度的HP-NAP刺激,流式細胞術(shù)對其表面共刺激分子CD80的表達進行檢測,確定HP-NAP對DC的刺激作用是否依賴于TLR2信號通路。5.向DC培養(yǎng)體系中加入B16F10-TCL和HP-NAP進行刺激。流式細胞術(shù)對DC表面共刺激分子CD80、CD86,趨化因子受體CCR7的表達變化以及DC抗原吞噬能力進行檢測;熒光定量PCR法對DC表達細胞因子IL-12、IL-23及IL-1β在m RNA水平的表達變化進行檢測,確定HP-NAP對荷載B16F10-TCL的DC成熟的影響。6.經(jīng)HP-NAP和B16F10-TCL處理DC細胞,與尼龍毛柱法純化得到的T細胞共培養(yǎng),MTT法檢測T細胞的增殖情況;流式細胞術(shù)檢測T細胞表面早期活化Marker CD69的表達變化;ELISA檢測上清中IFN-γ及IL-17A的濃度;熒光定量PCR法檢測IL-4、IL-10在m RNA水平的變化。7.對C57BL/6小鼠進行兩次200μg/只的B16F10-TCL的皮下注射,兩次注射之間間隔5天,第二次注射5或6天后取小鼠脾臟細胞,尼龍毛柱純化抗原特異性T細胞,與經(jīng)HP-NAP和B16F10-TCL處理的DC共培養(yǎng)后,熒光定量PCR法檢測顆粒酶及穿孔素在m RNA水平的變化;ELISA法檢測上清中IFN-γ的濃度;以其作為效應(yīng)細胞,與B16F10按照10:1,20:1,40:1的比例共培養(yǎng)6小時,LDH法檢測T細胞的殺傷能力。結(jié)果1.表達純化的HP-NAP純度及濃度達到實驗需求。2.誘導(dǎo)分化的DC純度85%以上,可以用于后續(xù)實驗。3.HP-NAP對DC的成熟有促進作用,1μM為HP-NAP對DC發(fā)揮刺激作用的最適濃度,選擇該濃度進行后續(xù)實驗。4.HP-NAP刺激后,野生型C57BL/6小鼠來源的DC表面的CD80表達顯著上調(diào),而TLR2缺陷型C57BL/6小鼠來源的DC表面的CD80的表達無明顯改變。5.HP-NAP和B16F10-TCL處理后的DC表面共刺激分子CD80、CD86及趨化因子受體CCR7表達量顯著上升,抗原吞噬能力顯著下降;HP-NAP和B16F10-TCL處理后的DC表達細胞因子IL-12、IL-23、IL-1β的水平顯著上調(diào)。6.HP-NAP和B16F10-TCL處理后的DC刺激T細胞增殖和活化的能力顯著上升。HP-NAP和B16F10-TCL處理后的DC可以顯著上調(diào)T細胞表達IFN-γ。7.HP-NAP和B16F10-TCL處理后的DC能夠刺激抗原特異性的T細胞合成細胞毒作用效應(yīng)分子Granzyme B和Proforine,并顯著上調(diào)IFN-γ的表達。HP-NAP和B16F10-TCL處理后的DC誘導(dǎo)抗原特異性CTL的能力顯著增強。結(jié)論1.HP-NAP通過TLR2發(fā)揮對DC成熟的刺激作用。2.HP-NAP能夠促進荷載B16F10-TCL的DC的成熟。3.HP-NAP處理的荷載B16F10-TCL的DC刺激T細胞增殖和活化的能力顯著增強并介導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答。4.HP-NAP顯著增強荷載B16F10-TCL的DC激發(fā)CTL的能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R739.5

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本文編號：2340851