【摘要】：目的： 葫蘆素B（CuB）是從葫蘆科植物中分離出的四環(huán)三萜類化合物，具有高度氧化性。近年研究發(fā)現(xiàn)，許多葫蘆素與兩面神激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（Janus Kinase/signalTransducer and Activator of Transcription, JAK/STAT）通路有關(guān)，而STAT3信號(hào)通路與其關(guān)系最為密切。研究顯示CuB能夠通過抑制STAT3活化而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。本研究的目的在于進(jìn)一步探討B(tài)16F10黑素瘤細(xì)胞中STAT3磷酸化與CuB抗腫瘤間的關(guān)系。 方法： 1.小鼠黑色素瘤高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B16F10細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、質(zhì)量濃度為100mg/L青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃及體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 2. B16F10黑素瘤細(xì)胞在含有6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM的AG490中培養(yǎng)24h、48h，應(yīng)用MTS法觀察AG490對細(xì)胞增殖活力的影響，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率和IC50，并選擇合適的AG490工作濃度。 3. CuB作用于B16F10黑素瘤細(xì)胞前，先用AG490預(yù)處理細(xì)胞2h。 B16F10黑色素瘤細(xì)胞分為對照組、AG490組、CuB組及AG490+CuB組，分別培養(yǎng)24h和48h后，利用MTS法進(jìn)行細(xì)胞活性分析，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定490nm波長處A值，并計(jì)算藥物對細(xì)胞存活率的影響。 4.碘化丙錠（PI）染色法檢測20μM AG490對不同濃度CuB處理的B16F10黑素瘤細(xì)胞細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。 5.采用免疫印跡檢測p-STAT3、STAT3以及MAPKs信號(hào)通路p-p38、p38、p-JNK、JNK蛋白的表達(dá)情況。 6.碘化丙錠（PI）染色法檢測40μM SP600125對不同濃度CuB處理的B16F10黑素瘤細(xì)胞細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果： 1. AG490預(yù)處理B16F10黑素瘤細(xì)胞2h后，再加入不同濃度的CuB作用24和48h，細(xì)胞增值率較單獨(dú)CuB處理組有明顯下降（P 0.05），提示AG490預(yù)處理可增強(qiáng)CuB對B16F10細(xì)胞的抑制作用。 2.細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果表明，AG490預(yù)處理對葫蘆素B誘導(dǎo)的黑素瘤細(xì)胞形態(tài)變化影響不大，但相對于CuB單獨(dú)作用組，AG490與CuB聯(lián)合作用組凋亡細(xì)胞相對較多，且AG490與低濃度的葫蘆素B作用還會(huì)引起細(xì)胞體積輕微變大。 3. CuB單獨(dú)作用可明顯影響B(tài)16F10黑素瘤細(xì)胞的周期分布。與對照組相比，CuB處理使G1期細(xì)胞顯著減少，G2/M期細(xì)胞顯著增加，形成四倍體細(xì)胞，并且低濃度藥物誘導(dǎo)的四倍體細(xì)胞比率高于高濃度藥物。AG490和CuB聯(lián)合用藥后，與CuB組細(xì)胞相比較，G1期細(xì)胞進(jìn)一步減少，G2/M期阻滯更為明顯，四倍體細(xì)胞的形成也明顯減少。此外，AG490還可明顯增加CuB誘導(dǎo)的凋亡峰比率（表2），兩藥聯(lián)用表現(xiàn)協(xié)同作用。 4.免疫印跡顯示，CuB作用4h后，p-STAT3蛋白表達(dá)有輕微升高，24h后，p-STAT3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。單獨(dú)AG490不改變p-STAT3水平，但可明顯降低CuB引起的p-STAT3水平，使p-STAT3/STAT3的比值從CuB組的0.86降低為AG490+CuB組的0.55，提示AG490對CuB誘導(dǎo)的STAT3活化能夠起到明顯的抑制作用。此外，免疫印跡還顯示CuB可以引起p38活化，而AG490預(yù)處理對葫蘆素B引起的p38活化有一定的影響。 5.實(shí)驗(yàn)室先前的研究結(jié)果表明CuB也可引起JNK途徑活化，，而JNK特異性抑制劑SP600125可以完全阻斷這一途徑，盡管SP600125對STAT3磷酸化沒有作用，但是SP600125與CuB聯(lián)合作用卻能夠完全抑制CuB引起的STAT3磷酸化。 6. CuB單獨(dú)處理組的sub-G0/G1期細(xì)胞百分比為0.83±0.13%，而CuB與SP600125聯(lián)合作用組的sub-G0/G1期細(xì)胞百分比與CuB單獨(dú)處理組相比明顯增多，分別為34.15±2.15%(1μM CuB和SP600125)、26.72±1.73%(10μM CuB和SP600125)。 結(jié)論： 1. CuB引起的STAT3磷酸化是一種代償效應(yīng)，其可以由JNK和Jak2途徑共同介導(dǎo)。 2. CuB通過激活STAT3使B16F10細(xì)胞對其產(chǎn)生一定的抗性，抑制STAT3的活化在一定程度上能阻斷腫瘤細(xì)胞對CuB的抗性，促進(jìn)CuB的抗腫瘤效應(yīng)。
[Abstract]:Purpose: cucurbitacin B (CuB) is a four-cyclic tri-polar compound separated from the plant of the cucurbitaceae, and has high oxygen content. In recent years, it has been found that many of the cucurbitacin are related to the two-sided kinase/ signal transduction and activator of transcription (JAK/ STAT) pathway, while the STAT3 signal pathway is the most important. The study shows that CuB can play an anti-tumor role by inhibiting the activation of STAT3. The purpose of this study was to further investigate the phosphorylation of STAT3 and the anti-tumor of CuB in B16F10 melanoma cells. The relationship. Methods: 1. The mouse melanoma highly metastatic cell line B16F10 was placed in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum with a mass concentration of 100 mg/ L of penicillin and streptomycin, and 5% CO2 at 37 鈩

本文編號(hào)：2327499