【摘要】： 人體表面的上皮細胞(Surface epithelial cells)如角質形成細胞(keratinocyte,KC)等,在經歷了細胞分化演變后形成一個復層表皮結構。該復層表皮結構是機體抵御外界影響的十分堅固的物理、化學屏障。而實現(xiàn)該屏障功能最關鍵的結構成分是位于表皮最淺層的角質膜套(cornified cell envelope, CE)。角質膜套是一個堅固的蛋白質／類脂聚合體,形成于細胞膜下,而固定于已死亡的角質細胞(cornified cells)表面。它包含蛋白膜套(protein envelope)和脂質膜套(lipid envelope)兩個部分。在角質形成細胞終末分化階段,內皮蛋白(involucrin)、兜甲蛋白(loricrin)、富含脯氨酸小蛋白(small proline-rich protein)等結構蛋白的共價交聯(lián),對于角質膜套的形成具有十分重要的意義。這些交聯(lián)反應需要轉谷氨酰胺酶1 (transglutaminase 1, TGase 1)的參與。轉谷氨酰胺酶1是一個鈣離子依賴性酶,可以催化蛋白分子間異肽鍵的形成。 轉谷氨酰胺酶1在角質形成細胞的終末分化階段,開始表達并被激活,通過交聯(lián)反應來促進角質膜套的生成。編碼轉谷氨酰胺酶1的基因(TGM 1)已經被學者從人類基因組DNA中分離出來,并進行了描述。其含有14.3千堿基對,包含了15個外顯子。轉谷氨酰胺酶1是參與角質膜套的合成而被人們所認識的。在角質形成細胞分化進程中,轉谷氨酰胺酶1被蛋白水解酶有限裂解而激活,進而參與到隨后的底物交聯(lián)中去。因此,轉谷氨酰胺酶1活性的紊亂可以產生異常的皮膚表型。 內皮蛋白是第一個被發(fā)現(xiàn)和克隆的前體物質,是角質膜套的一個重要的組成成分。其開始表達于角質形成細胞分化階段早期,被認為是早期膜套的組成成分,為隨后其它的前體物質的交聯(lián)提供膜套支架。在體外,該交聯(lián)優(yōu)先選擇Gln496位點。交聯(lián)是一個有序的過程,Gln496是第一個交聯(lián)位點,其他的交聯(lián)位點隨時間的往后推移而逐漸發(fā)揮作用。 板層狀魚鱗病(Lamellar ichthyosis, LI)是一種常染色體隱性遺傳病,是一種嚴重的皮膚角化紊亂,表現(xiàn)為皮膚的泛發(fā)性過度角化。由于在表皮終末分化階段,轉谷氨酰胺酶1介導了細胞膜套交聯(lián)的形成,所以TGM 1突變造成的轉谷氨酰胺酶1的功能缺陷被普遍認為是板層狀魚鱗病的病因。此外,在板層狀魚鱗病患者的異常角質膜套中,人們觀察到了過度表達的內皮蛋白。因此,轉谷氨酰胺酶1的功能異常可以改變內皮蛋白的交聯(lián)和角質膜套的形成。但是,轉谷氨酰胺酶1的活性和內皮蛋白的表達兩者之間的聯(lián)系仍然不清楚,亦未見有相關報道。 本實驗對板層狀魚鱗病患者TGM 1基因的突變,板層狀魚鱗病患者和對照組的轉谷氨酰胺酶1的活性、內皮蛋白的表達以及轉谷氨酰胺酶1的活性和內皮蛋白的表達兩者之間的相關性進行了探討。 1.收集8例板層狀魚鱗病患者(LI組)和8例志愿者(對照C組)指甲,并抽取2例板層狀魚鱗病血液標本。 2.將抽取的2例板層狀魚鱗病血液標本送本元正陽基因公司進行TGM1基因序列分析。 3.采用CellyticTM試劑提取指甲總蛋白。 4.樣品蛋白進行SDS-PAGE電泳,對電泳條帶進行轉膜,再采用免疫印跡法檢測內皮蛋白。(圖像分析)。 5.采用斑點印跡法檢測TGase 1酶活性。(圖像分析)。 6.采用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件進行兩組間的方差分析和相關性分析。 1.患者TGM 1基因序列分析：2例LI患者TGM 1基因序列的第3、8、12及13外顯子皆有錯義的點突變,其中1例癥狀較重者還有第3外顯子150T的缺失導致的提前終止。 2.兩組指甲總蛋白SDS-PAGE電泳結果比較：LI組指甲總蛋白SDS-PAGE電泳顯示5條主帶,即69kDa、63kDa、54kDa、48kDa、38kDa,C組顯示后4條主帶。LI組69kDa、63kDa的灰度均值(GSM)分別為131.98±1.35、154.36±1.46,C組63kDa的GSM為136.56±1.38,兩組63kDa的GSM相比,P0.05。 3.兩組指甲內皮蛋白表達的GSM比較：LI組內皮蛋白表達于69kDa、63kDa主帶,其GSM分別為139.92±1.44、148.54±1.6；C組內皮蛋白表達于63kDa主帶,其GSM為135.96±1.10。兩組63kDa內皮蛋白表達的GSM相比,P0.05。 4.兩組指甲TGase 1酶活性的GSM比較：TGase 1的GSM為122.49±1.32,C組為169.11±1.14,C組TGase 1斑點印跡信號強于LI組,兩組相比,P0.05。 5.內皮蛋白表達與TGase 1酶活性的相關性：C組63kDa內皮蛋白表達與TGase1酶的GSM呈正相關(r=0.762,P0.05),LI組63kDa、69kDa內皮蛋白與TGase 1酶的GSM呈負相關(r分別為-0.780、-0.837,P均0.05)。 1.兩例板層狀魚鱗病患者的TGM 1基因序列分析,顯示第8、12、及13外顯子皆有錯義的點突變,其中1例癥狀較重患者還有第3外顯子150T的缺失導致的提前終止,提示LI組的TGase 1的表達存在異常。 2.LI組指甲總蛋白SDS-PAGE電泳顯示5條主帶,而C組顯示4條主帶,提示LI組的指甲總蛋白存在異常。 3.LI組內皮蛋白表達于69kDa、63kDa主帶,C組內皮蛋白定位于63kDa主帶,提示LI組內皮蛋白可能過度表達。 4.C組TGase 1斑點印跡信號強于LI組,提示LI組的TGase 1活性弱于對照組C組。 5.C組63kDa內皮蛋白表達與TGase 1酶活性的GSM呈正相關,LI組69kDa、63kDa內皮蛋白表達與TGase 1酶活性的GSM呈負相關,提示LI組內皮蛋白的過度表達可能是對TGase 1酶活性異常導致LI患者皮膚屏障功能缺陷的一種代償性表達。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R758.52

【參考文獻】

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1 張晨陽;李紅文;鄭乃剛;王一菱;吳景蘭;;板層狀魚鱗病患者指甲和鱗屑內皮蛋白及鱗屑類脂的變化[J];鄭州大學學報(醫(yī)學版);2008年01期

2 劉瑋;;皮膚屏障功能解析[J];中國皮膚性病學雜志;2008年12期

3 陸國芳;張穎;;遺傳性魚鱗病發(fā)病機制的研究進展[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2007年12期

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本文編號：2316370