【摘要】：第一部分 RasGRP1在濕疹患者外周血單個(gè)核細(xì)胞及T細(xì)胞中的表達(dá)及意義 目的研究RasGRP1在濕疹患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)1中的表達(dá),純化PBMC中的T細(xì)胞,進(jìn)一步研究RasGRP1在濕疹患者外周血T細(xì)胞中的表達(dá),并探討其意義。 方法使用Ficoll法提取濕疹患者及正常人外周血中的PBMC,采用免疫磁珠分選法從PBMC中分選T細(xì)胞,驗(yàn)證T細(xì)胞的分選純度。使用RT-PCR及Western Blot方法檢測(cè)濕疹患者及正常人外周血PBMC和T細(xì)胞中RasGRP1的表達(dá)。 結(jié)果使用Ficoll法提取的外周血PBMC的純度接近1000%,而使用免疫磁珠分選法分選T細(xì)胞,其純度能達(dá)到98%以上。在PBMC中,濕疹患者RasGRP1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平明顯高于正常人,在純化后的T細(xì)胞中,濕疹患者RasGRP1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平也明顯高于正常人。 結(jié)論使用免疫磁珠分選外周血PBMC中的T細(xì)胞純度較高。濕疹患者外周血PBMC及T細(xì)胞中RasGRP1的表達(dá)水平均增高,提示T細(xì)胞中RasGRP1的異常表達(dá)可能是濕疹發(fā)病過程中的一個(gè)重要因素。 第二部分 地塞米松對(duì)濕疹患者T細(xì)胞中RasGRP1表達(dá)的作用及意義 目的研究地塞米松對(duì)濕疹患者外周血T細(xì)胞中RasGRP1的作用,篩選產(chǎn)生作用的最適濃度,并探討地塞米松對(duì)T細(xì)胞的影響及意義。 方法選取臨床上使用地塞米松的重癥濕疹患者,抽取其地塞米松治療前及治療后的外周血,并純化T細(xì)胞。檢測(cè)地塞米松治療前后T細(xì)胞內(nèi)RasGRP1的表達(dá)水平。在體外實(shí)驗(yàn)中,將地塞米松配成三種不同濃度1×10-5mol/L、1×10-6mol/L及1×10-7mol/L,與未用激素治療的濕疹患者外周血T細(xì)胞共同培養(yǎng),使用RT-PCR的方法檢測(cè)T細(xì)胞內(nèi)RasGRP1的mRNA水平。并得出最適合的作用濃度。將此濃度的地塞米松作用于T細(xì)胞,觀察不同時(shí)間點(diǎn)(0h、6h、12h、18h、24h)地塞米松對(duì)T細(xì)胞內(nèi)RasGRP1表達(dá)的影響。使用MTT的方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度的地塞米松作用于T細(xì)胞時(shí),對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果未使用地塞米松治療時(shí),濕疹患者T細(xì)胞內(nèi)RasGRP1的表達(dá)高于正常人,使用地塞米松治療1周后,T細(xì)胞內(nèi)RasGRP1的表達(dá)明顯下降,接近正常人的表達(dá)水平。地塞米松能抑制濕疹患者外周血T細(xì)胞RasGRP1的表達(dá),在三種不同濃度的地塞米松中,1×10-Smol/L的濃度對(duì)RasGRP1表達(dá)的抑制作用最明顯。使用濃度為1×104mo1/L的地塞米松對(duì)濕疹患者外周T細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的刺激,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),地塞米松的抑制作用加強(qiáng)。24h時(shí)地塞米松對(duì)T細(xì)胞內(nèi)RasGRP1的抑制作用最強(qiáng)。而不同濃度的地塞米松均能促進(jìn)T細(xì)胞的凋亡,這種作用呈時(shí)間依賴性。 結(jié)論地塞米松能抑制濕疹患者外周血T細(xì)胞中RasGRP1的表達(dá),并促進(jìn)T細(xì)胞的凋亡。這種抑制作用隨著地塞米松濃度的增加而增加,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而加強(qiáng)。濕疹患者在臨床治療時(shí),使用地塞米松治療1周后,外周血T細(xì)胞內(nèi)RasGRP1的水平下降,接近正常人水平。這可能為激素的抗炎機(jī)制增加了新觀點(diǎn)。 第三部分 構(gòu)建含有H-RasGRP1-shRNA的慢病毒載體及其對(duì)T細(xì)胞的干擾效應(yīng) 目的以RasGRP1為靶點(diǎn),構(gòu)建含有目的基因H-RasGRP1-shRNA的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染T細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行RNA干擾,觀察轉(zhuǎn)染后T細(xì)胞表達(dá)RasGRP1的變化。研究基因沉默RasGRP1后對(duì)T細(xì)胞內(nèi)Ras下游信號(hào)通路蛋白的影響,以及對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞因子分泌的影響,并探討其作用機(jī)制。 方法構(gòu)建含有目的基因H-RasGRP1-shRNA的慢病毒載體,并檢測(cè)其生物學(xué)滴度。對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,使用RT-PCR和Western Blot的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)(12h、24h、48h、72h)T細(xì)胞內(nèi)RasGRP1的表達(dá)情況,并使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞的凋亡。使用12-十四酸佛波酯-13-乙酸鹽(Phorbol12-myristate13-acetate, PMA)及離子霉素刺激T細(xì)胞,觀察T細(xì)胞內(nèi)Ras蛋白下游信號(hào)通路蛋白p-Erk、Erk、Akt及p-Akt的表達(dá)。用ELISA的方法檢測(cè)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-2、IL-4及IL-17的情況。使用慢病毒載體轉(zhuǎn)染PMA及離子霉素刺激后的T細(xì)胞,觀察轉(zhuǎn)染后T細(xì)胞內(nèi)p-Erk、Erk、Akt及p-Akt蛋白表達(dá)的變化,以及T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的變化。 結(jié)果成功構(gòu)建H-RasGRP1-shRNA的慢病毒載體,其生物學(xué)滴度達(dá)到1.0×108TU/ml,符合轉(zhuǎn)染要求。使用慢病毒載體轉(zhuǎn)染T細(xì)胞后,T細(xì)胞內(nèi)RasGRP1的mRNA及蛋白水平下降,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)(12h、24h、48h、72h),RasGRP1的表達(dá)逐漸下降,72h時(shí)RasGRP1的表達(dá)幾乎消失。同時(shí)轉(zhuǎn)染后T細(xì)胞的凋亡加快。使用PMA及離子霉素對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行刺激,刺激前,濕疹患者和正常人T細(xì)胞內(nèi)均有p-Erk、p-Akt、Erk及Akt的表達(dá),且濕疹患者的表達(dá)高于正常人。使用PMA及離子霉素刺激后,p-Erk、p-Akt、 Erk及Akt的表達(dá)水平明顯增高,以濕疹患者增加的更為明顯。T細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子IL-2、IL-4及IL-17的水平明顯增加。用慢病毒顆�；蜣D(zhuǎn)染PMA及離子霉素刺激后的T細(xì)胞,T細(xì)胞內(nèi)p-Erk及p-Akt表達(dá)下降,而Erk及Akt的表達(dá)無(wú)明顯變化。T細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中分泌的細(xì)胞因子IL-2、IL-4及IL-17的表達(dá)水平下降。 結(jié)論成功構(gòu)建含目的基因H-RasGRP1-shRNA的慢病毒載體,其生物學(xué)滴度能滿足轉(zhuǎn)染要求。慢病毒載體能成功轉(zhuǎn)染T細(xì)胞,抑制T細(xì)胞內(nèi)RasGRP1的表達(dá)。RasGRP1基因沉默后,T細(xì)胞的凋亡增加。當(dāng)濕疹發(fā)生時(shí),T細(xì)胞受體活化后可能通過活化RasGRP1的表達(dá),介導(dǎo)Ras蛋白的下游信號(hào)分子Erk及Akt的磷酸化,導(dǎo)致T細(xì)胞細(xì)胞因子釋放增加。由此可見,RasGRP1可能成為濕疹治療中的一個(gè)作用靶點(diǎn),為基因治療及免疫治療提供新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R758.23

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本文編號(hào)：2304360