【摘要】：第一部分 RasGRP1在濕疹患者外周血單個核細胞及T細胞中的表達及意義 目的研究RasGRP1在濕疹患者外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)1中的表達,純化PBMC中的T細胞,進一步研究RasGRP1在濕疹患者外周血T細胞中的表達,并探討其意義。 方法使用Ficoll法提取濕疹患者及正常人外周血中的PBMC,采用免疫磁珠分選法從PBMC中分選T細胞,驗證T細胞的分選純度。使用RT-PCR及Western Blot方法檢測濕疹患者及正常人外周血PBMC和T細胞中RasGRP1的表達。 結果使用Ficoll法提取的外周血PBMC的純度接近1000%,而使用免疫磁珠分選法分選T細胞,其純度能達到98%以上。在PBMC中,濕疹患者RasGRP1的mRNA和蛋白質的表達水平明顯高于正常人,在純化后的T細胞中,濕疹患者RasGRP1的mRNA和蛋白質的表達水平也明顯高于正常人。 結論使用免疫磁珠分選外周血PBMC中的T細胞純度較高。濕疹患者外周血PBMC及T細胞中RasGRP1的表達水平均增高,提示T細胞中RasGRP1的異常表達可能是濕疹發(fā)病過程中的一個重要因素。 第二部分 地塞米松對濕疹患者T細胞中RasGRP1表達的作用及意義 目的研究地塞米松對濕疹患者外周血T細胞中RasGRP1的作用,篩選產生作用的最適濃度,并探討地塞米松對T細胞的影響及意義。 方法選取臨床上使用地塞米松的重癥濕疹患者,抽取其地塞米松治療前及治療后的外周血,并純化T細胞。檢測地塞米松治療前后T細胞內RasGRP1的表達水平。在體外實驗中,將地塞米松配成三種不同濃度1×10-5mol/L、1×10-6mol/L及1×10-7mol/L,與未用激素治療的濕疹患者外周血T細胞共同培養(yǎng),使用RT-PCR的方法檢測T細胞內RasGRP1的mRNA水平。并得出最適合的作用濃度。將此濃度的地塞米松作用于T細胞,觀察不同時間點(0h、6h、12h、18h、24h)地塞米松對T細胞內RasGRP1表達的影響。使用MTT的方法檢測不同時間點、不同濃度的地塞米松作用于T細胞時,對細胞凋亡的影響。 結果未使用地塞米松治療時,濕疹患者T細胞內RasGRP1的表達高于正常人,使用地塞米松治療1周后,T細胞內RasGRP1的表達明顯下降,接近正常人的表達水平。地塞米松能抑制濕疹患者外周血T細胞RasGRP1的表達,在三種不同濃度的地塞米松中,1×10-Smol/L的濃度對RasGRP1表達的抑制作用最明顯。使用濃度為1×104mo1/L的地塞米松對濕疹患者外周T細胞進行不同時間點的刺激,隨著時間的延長,地塞米松的抑制作用加強。24h時地塞米松對T細胞內RasGRP1的抑制作用最強。而不同濃度的地塞米松均能促進T細胞的凋亡,這種作用呈時間依賴性。 結論地塞米松能抑制濕疹患者外周血T細胞中RasGRP1的表達,并促進T細胞的凋亡。這種抑制作用隨著地塞米松濃度的增加而增加,隨著時間的延長而加強。濕疹患者在臨床治療時,使用地塞米松治療1周后,外周血T細胞內RasGRP1的水平下降,接近正常人水平。這可能為激素的抗炎機制增加了新觀點。 第三部分 構建含有H-RasGRP1-shRNA的慢病毒載體及其對T細胞的干擾效應 目的以RasGRP1為靶點,構建含有目的基因H-RasGRP1-shRNA的慢病毒載體,轉染T細胞對其進行RNA干擾,觀察轉染后T細胞表達RasGRP1的變化。研究基因沉默RasGRP1后對T細胞內Ras下游信號通路蛋白的影響,以及對細胞凋亡和細胞因子分泌的影響,并探討其作用機制。 方法構建含有目的基因H-RasGRP1-shRNA的慢病毒載體,并檢測其生物學滴度。對T細胞進行轉染,使用RT-PCR和Western Blot的方法檢測轉染后不同時間點(12h、24h、48h、72h)T細胞內RasGRP1的表達情況,并使用流式細胞儀檢測T細胞的凋亡。使用12-十四酸佛波酯-13-乙酸鹽(Phorbol12-myristate13-acetate, PMA)及離子霉素刺激T細胞,觀察T細胞內Ras蛋白下游信號通路蛋白p-Erk、Erk、Akt及p-Akt的表達。用ELISA的方法檢測T細胞分泌細胞因子IL-2、IL-4及IL-17的情況。使用慢病毒載體轉染PMA及離子霉素刺激后的T細胞,觀察轉染后T細胞內p-Erk、Erk、Akt及p-Akt蛋白表達的變化,以及T細胞分泌細胞因子的變化。 結果成功構建H-RasGRP1-shRNA的慢病毒載體,其生物學滴度達到1.0×108TU/ml,符合轉染要求。使用慢病毒載體轉染T細胞后,T細胞內RasGRP1的mRNA及蛋白水平下降,隨著時間的延長(12h、24h、48h、72h),RasGRP1的表達逐漸下降,72h時RasGRP1的表達幾乎消失。同時轉染后T細胞的凋亡加快。使用PMA及離子霉素對T細胞進行刺激,刺激前,濕疹患者和正常人T細胞內均有p-Erk、p-Akt、Erk及Akt的表達,且濕疹患者的表達高于正常人。使用PMA及離子霉素刺激后,p-Erk、p-Akt、 Erk及Akt的表達水平明顯增高,以濕疹患者增加的更為明顯。T細胞表達細胞因子IL-2、IL-4及IL-17的水平明顯增加。用慢病毒顆粒基因轉染PMA及離子霉素刺激后的T細胞,T細胞內p-Erk及p-Akt表達下降,而Erk及Akt的表達無明顯變化。T細胞的培養(yǎng)上清液中分泌的細胞因子IL-2、IL-4及IL-17的表達水平下降。 結論成功構建含目的基因H-RasGRP1-shRNA的慢病毒載體,其生物學滴度能滿足轉染要求。慢病毒載體能成功轉染T細胞,抑制T細胞內RasGRP1的表達。RasGRP1基因沉默后,T細胞的凋亡增加。當濕疹發(fā)生時,T細胞受體活化后可能通過活化RasGRP1的表達,介導Ras蛋白的下游信號分子Erk及Akt的磷酸化,導致T細胞細胞因子釋放增加。由此可見,RasGRP1可能成為濕疹治療中的一個作用靶點,為基因治療及免疫治療提供新的思路。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R758.23

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本文編號：2304360