【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)探討應(yīng)用RNA干擾(RNA Interference,RNAi)技術(shù)下調(diào)纖溶酶原激活抑制劑-1(Plasminogen Activator Inhibitor-1,PAI-1)表達(dá)對(duì)SD大鼠皮膚成纖維細(xì)胞(fibroblast)增殖的影響,通過體外實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平探究PAI-1對(duì)成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化的作用,進(jìn)一步為前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)PAI-1 siRNA可改善SD大鼠瘢痕疙瘩模型提供理論依據(jù),為瘢痕疙瘩(keloid)基因治療開辟新思路。方法:1 SD大鼠皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)采用組織塊培養(yǎng)法獲取原代SD大鼠皮膚成纖維細(xì)胞,經(jīng)傳代培養(yǎng)去除上皮細(xì)胞、紅細(xì)胞等雜質(zhì)成分,獲取單一成纖維細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)變化。2免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定細(xì)胞應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法,通過檢測(cè)波形蛋白表達(dá)是否陽性,鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞是否為成纖維細(xì)胞。3 PAI-1 siRNA轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞,并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組利用脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000)轉(zhuǎn)染siRNA至體外培養(yǎng)傳代至第六代的成纖維細(xì)胞,根據(jù)轉(zhuǎn)染不同設(shè)置實(shí)驗(yàn)分組為:轉(zhuǎn)染PAI-1 siRNA的實(shí)驗(yàn)組、轉(zhuǎn)染NC siRNA的陰性對(duì)照組、不進(jìn)行轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組。4應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24小時(shí),PAI-1 m RNA、TGF-β1 m RNA的表達(dá)。5應(yīng)用Western blot法測(cè)定轉(zhuǎn)染48小時(shí),PAI-1、AKT、ERK、p-AKT、p-ERK蛋白的表達(dá)。6應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)細(xì)胞并繪制曲線。分別于轉(zhuǎn)染24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí),制備細(xì)胞懸液進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色,鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)以及未被染液染色的細(xì)胞總數(shù)(或被染色的細(xì)胞總數(shù)),以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),細(xì)胞計(jì)數(shù)為縱坐標(biāo),繪制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及成纖維細(xì)胞成活率曲線。7應(yīng)用CCK-8測(cè)定成纖維細(xì)胞的增殖活力繪制曲線。分別于轉(zhuǎn)染24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)加入CCK-8試劑,孵育4小時(shí)后,通過使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定吸光度(OD值),根據(jù)計(jì)算公式,得出細(xì)胞的OD值、細(xì)胞增殖抑制百分率(%)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),細(xì)胞的OD值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線;以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),細(xì)胞增殖抑制百分率(%)為縱坐標(biāo)繪制增殖抑制率曲線。8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)量資料,采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)行數(shù)據(jù)分析之前,先分析數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性。若數(shù)據(jù)服從正態(tài)性分布且方差齊時(shí),則多樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間比較采用SNK-q檢驗(yàn);若不服從正態(tài)性分布或方差不齊,則選用秩和檢驗(yàn)中的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。結(jié)果:1采用組織塊培養(yǎng)法成功獲取SD大鼠皮膚成纖維細(xì)胞,經(jīng)傳代至第5-6代可獲取單一成分的成纖維細(xì)胞;2采用免疫細(xì)胞化學(xué)法染色檢測(cè)波形蛋白,鏡下可見培養(yǎng)細(xì)胞胞漿顯示棕色或棕黃色顆粒,細(xì)胞核未見著色,即波形蛋白抗體染色陽性,證實(shí)實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)細(xì)胞是成纖維細(xì)胞;3應(yīng)用Real time PCR檢測(cè)PAI-1成功轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞,成纖維細(xì)胞中PAI-1 m RNA、TGF-β1 m RNA表達(dá)明顯降低,三組間RQ值總體均數(shù)不同或不全相同(P0.05),實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組間、實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而陰性對(duì)照與空白組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);4應(yīng)用Western blot檢測(cè)成功轉(zhuǎn)染PAI-1 siRNA,成纖維細(xì)胞中PAI-1、p-AKT、p-ERK蛋白的表達(dá)明顯下調(diào),實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組間、實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而陰性對(duì)照與空白組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而對(duì)去磷酸化狀態(tài)AKT、ERK無影響,三組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);5臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)細(xì)胞,繪制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及成活率曲線可見隨著時(shí)間進(jìn)展轉(zhuǎn)染PAI-1 siRNA后成纖維細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)速度較陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組明顯減慢,細(xì)胞成活率顯著降低;6采用CCK-8試劑測(cè)定繪制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及成纖維細(xì)胞增殖抑制率曲線,觀察走勢(shì),與對(duì)照組相比可見轉(zhuǎn)染PAI-1 siRNA后的成纖維細(xì)胞增殖活力低,增殖抑制率較高。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)研究成功獲取原代SD大鼠皮膚成纖維細(xì)胞,選取傳代至第五或第六代細(xì)胞,轉(zhuǎn)染PAI-1 siRNA,經(jīng)一系列實(shí)驗(yàn)得出干擾PAI-1表達(dá)可抑制SD大鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化,抑制TGF-β1表達(dá),抑制AKT、ERK信號(hào)途徑,從而表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞增殖速度減慢,增殖活力降低,成活率降低。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R751

【參考文獻(xiàn)】

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1 周俊;馬慧群;;瘢痕的臨床類型及治療進(jìn)展[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)文摘(皮膚科學(xué));2015年01期

2 覃莉;王s，

本文編號(hào)：2281638