發(fā)布時間：2018-10-19 16:08

【摘要】：目的:本實驗探討應用RNA干擾(RNA Interference,RNAi)技術下調纖溶酶原激活抑制劑-1(Plasminogen Activator Inhibitor-1,PAI-1)表達對SD大鼠皮膚成纖維細胞(fibroblast)增殖的影響,通過體外實驗從細胞水平探究PAI-1對成纖維細胞增殖、轉化的作用,進一步為前期動物實驗PAI-1 siRNA可改善SD大鼠瘢痕疙瘩模型提供理論依據(jù),為瘢痕疙瘩(keloid)基因治療開辟新思路。方法:1 SD大鼠皮膚成纖維細胞培養(yǎng)采用組織塊培養(yǎng)法獲取原代SD大鼠皮膚成纖維細胞,經傳代培養(yǎng)去除上皮細胞、紅細胞等雜質成分,獲取單一成纖維細胞,倒置顯微鏡下觀察細胞生長及形態(tài)變化。2免疫細胞化學法鑒定細胞應用免疫細胞化學法,通過檢測波形蛋白表達是否陽性,鑒定所培養(yǎng)的細胞是否為成纖維細胞。3 PAI-1 siRNA轉染至體外培養(yǎng)的成纖維細胞,并進行實驗分組利用脂質體(Lipofectamine 2000)轉染siRNA至體外培養(yǎng)傳代至第六代的成纖維細胞,根據(jù)轉染不同設置實驗分組為:轉染PAI-1 siRNA的實驗組、轉染NC siRNA的陰性對照組、不進行轉染的空白對照組。4應用RT-PCR法檢測轉染24小時,PAI-1 m RNA、TGF-β1 m RNA的表達。5應用Western blot法測定轉染48小時,PAI-1、AKT、ERK、p-AKT、p-ERK蛋白的表達。6應用臺盼藍染色法計數(shù)細胞并繪制曲線。分別于轉染24小時、48小時、72小時,制備細胞懸液進行臺盼藍染色,鏡下計數(shù)細胞總數(shù)以及未被染液染色的細胞總數(shù)(或被染色的細胞總數(shù)),以培養(yǎng)時間為橫坐標,細胞計數(shù)為縱坐標,繪制成纖維細胞生長曲線及成纖維細胞成活率曲線。7應用CCK-8測定成纖維細胞的增殖活力繪制曲線。分別于轉染24小時、48小時、72小時加入CCK-8試劑,孵育4小時后,通過使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度(OD值),根據(jù)計算公式,得出細胞的OD值、細胞增殖抑制百分率(%)。以培養(yǎng)時間為橫坐標,細胞的OD值為縱坐標繪制生長曲線;以培養(yǎng)時間為橫坐標,細胞增殖抑制百分率(%)為縱坐標繪制增殖抑制率曲線。8統(tǒng)計學處理本實驗所有數(shù)據(jù)應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件,實驗數(shù)據(jù)為計量資料,采用均數(shù)±標準差表示,統(tǒng)計結果以P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。進行數(shù)據(jù)分析之前,先分析數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性。若數(shù)據(jù)服從正態(tài)性分布且方差齊時,則多樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間比較采用SNK-q檢驗;若不服從正態(tài)性分布或方差不齊,則選用秩和檢驗中的Kruskal-Wallis H檢驗,組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。結果:1采用組織塊培養(yǎng)法成功獲取SD大鼠皮膚成纖維細胞,經傳代至第5-6代可獲取單一成分的成纖維細胞;2采用免疫細胞化學法染色檢測波形蛋白,鏡下可見培養(yǎng)細胞胞漿顯示棕色或棕黃色顆粒,細胞核未見著色,即波形蛋白抗體染色陽性,證實實驗所培養(yǎng)細胞是成纖維細胞;3應用Real time PCR檢測PAI-1成功轉染成纖維細胞,成纖維細胞中PAI-1 m RNA、TGF-β1 m RNA表達明顯降低,三組間RQ值總體均數(shù)不同或不全相同(P0.05),實驗組與陰性對照組間、實驗組與空白對照組間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而陰性對照與空白組間無統(tǒng)計學意義(P0.05);4應用Western blot檢測成功轉染PAI-1 siRNA,成纖維細胞中PAI-1、p-AKT、p-ERK蛋白的表達明顯下調,實驗組與陰性對照組間、實驗組與空白對照組間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而陰性對照與空白組間無統(tǒng)計學意義(P0.05);而對去磷酸化狀態(tài)AKT、ERK無影響,三組之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);5臺盼藍染色后計數(shù)細胞,繪制成纖維細胞生長曲線及成活率曲線可見隨著時間進展轉染PAI-1 siRNA后成纖維細胞數(shù)量增長速度較陰性對照組與空白對照組明顯減慢,細胞成活率顯著降低;6采用CCK-8試劑測定繪制成纖維細胞生長曲線及成纖維細胞增殖抑制率曲線,觀察走勢,與對照組相比可見轉染PAI-1 siRNA后的成纖維細胞增殖活力低,增殖抑制率較高。結論:本實驗研究成功獲取原代SD大鼠皮膚成纖維細胞,選取傳代至第五或第六代細胞,轉染PAI-1 siRNA,經一系列實驗得出干擾PAI-1表達可抑制SD大鼠皮膚成纖維細胞增殖、轉化,抑制TGF-β1表達,抑制AKT、ERK信號途徑,從而表現(xiàn)為成纖維細胞增殖速度減慢,增殖活力降低,成活率降低。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R751

【參考文獻】

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1 周俊;馬慧群;;瘢痕的臨床類型及治療進展[J];中國醫(yī)學文摘(皮膚科學);2015年01期

2 覃莉;王s，

本文編號：2281638