【摘要】：【研究背景】男性脫發(fā)癥(AGA)是世界上最常見的皮膚疾病之一,困擾著我國超過1億的成年男性。且其發(fā)病率隨著我國社會生活的快節(jié)奏化和人口老齡化,而呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。已知AGA的主要誘因是雄激素雙氫睪酮(DHT)體內(nèi)濃度改變。另外遺傳背景、營養(yǎng)狀況、精神壓力、衰老程度、免疫反應、外來損傷等因素也在AGA發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。但這種疾病的具體發(fā)病機制至今仍不完全清楚。目前臨床上可用于治療AGA的藥物僅有抑制DHT生成的Finasteride和血管擴張劑Minoxidil兩種。前者有影響男性性功能的潛在副作用,后者在停藥后會導致更為嚴重的脫發(fā),在臨床上均難以實現(xiàn)理想的療效。而開發(fā)更為有效的AGA治療方法將需要我們深入解析AGA的發(fā)病機制,并開發(fā)其針對性的干預手段。男性脫發(fā)具有較為固定的發(fā)展模式。一般前額與頭頂部最先禿發(fā),而枕后部區(qū)域的毛發(fā)則保持生長。將枕后部毛囊移植到前額禿發(fā)區(qū)仍可正常生長毛發(fā),提示毛發(fā)生長停滯的根本原因在于毛囊自身而非其周邊環(huán)境(20世紀50年代提出的“優(yōu)勢供區(qū)”理論)。毛發(fā)生長由毛囊內(nèi)部的毛囊干細胞驅(qū)動,并隨著這些干細胞在激活與靜止狀態(tài)之間的來回切換而呈現(xiàn)出生長-退行-休止的周期性循環(huán)。在AGA的發(fā)病過程中毛囊逐步萎縮,生長期縮短,休止期延長,最終失去再生毛發(fā)的能力。但我們對毛囊干細胞在這個疾病過程中的病理轉(zhuǎn)變過程及其機制仍然缺乏了解。有研究顯示脫發(fā)區(qū)域中的毛囊干細胞并未消失,只是處于異常的休止狀態(tài)而無法產(chǎn)生毛發(fā)。而闡明這種異常休止狀態(tài)的分子機制將為其針對性治療方案的開發(fā)提供線索。既往文獻中對AGA的病理學分析多基于禿發(fā)頭皮與健康頭皮的直接對比。但完全禿發(fā)區(qū)域的毛囊往往存在結(jié)構(gòu)異常、脂溢、感染、發(fā)炎等現(xiàn)象。不易區(qū)分導致脫發(fā)的直接病理因素與次生現(xiàn)象,也未能闡明毛囊干細胞在AGA發(fā)展過程中的病理轉(zhuǎn)變過程。在本課題中,為了深入闡明毛囊干細胞在AGA發(fā)病中的病理轉(zhuǎn)變過程及其分子機制,本人將從脫發(fā)癥患者前額脫發(fā)區(qū)邊緣剛開始毳毛化但尚未完全禿發(fā)的臨界區(qū)域中收集毛囊樣品,并與來自同一患者的枕后部未脫發(fā)區(qū)頭皮及健康人頭皮的毛囊樣品進行對比分析,解析它們在形態(tài)結(jié)構(gòu)以及其中毛囊干細胞數(shù)量、位置、增殖、分化上的差異。隨后,本人還將開發(fā)一套從人類毛囊樣品中分離純化毛囊干細胞的有效技術(shù)手段,并在國際上首次嘗試對脫發(fā)臨界區(qū)及對照區(qū)域的毛囊干細胞進行轉(zhuǎn)錄組比較分析。通過這些研究,我將進一步揭示AGA發(fā)病的毛囊干細胞機制,為開發(fā)AGA的新型靶向治療方案奠定基礎(chǔ)。【目的】(1)對比aga脫發(fā)臨界區(qū)、枕后區(qū)以及正常人群枕后區(qū)的毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)及其中的毛囊干細胞數(shù)量、位置、增殖、分化之間的差異。(2)建立從頭皮樣品中分離純化人類毛囊干細胞的技術(shù)體系。(3)建立對微量毛囊細胞進行轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)體系,并轉(zhuǎn)錄組分析探索aga脫發(fā)臨界毛囊干細胞與正常毛囊干細胞的基因表達差異。【方法】(1)對aga人群脫發(fā)臨界區(qū)、枕后區(qū)與正常人群(男、女)枕后區(qū)的毛囊進行解剖觀察不同毛囊組間的形態(tài)學差異,測量毛囊單位的生長期毛囊數(shù)量以及生長期毛囊的長度;通過對不同組間毛囊進行免疫組化分析,分別從毛囊的結(jié)構(gòu)、干細胞、增殖等方面進行對比分析,獲得病變與正常毛囊的基本數(shù)據(jù),旨在能系統(tǒng)性分析病變與正常毛囊間的大體存在的差異性。(2)擬以顯微操作與酶消化法相聯(lián)合,通過dispaseii分散酶從皮膚中分離毛囊,構(gòu)建一個毛囊模型。對所構(gòu)建的毛囊模型分別進行he染色、免疫組化實驗,觀察毛囊結(jié)構(gòu),驗證毛囊模型的純度及完整性。通過構(gòu)建毛囊模型,進一步比較aga臨界毛囊、aga枕后毛囊與正常人毛囊的干細胞含量的差異。同時通過磁珠免疫法進一步純化毛囊細胞,為純化分離毛囊干細胞提供一種新的方法,并驗證此方法的切實可行性。(3)擬以repli-gwtasinglecellkit擴增毛囊微量細胞轉(zhuǎn)錄組基因,nebnextdnalibraryprepmastermixsetforillumina試劑盒進行擴增后dna建庫。通過nano分光光度計、跑膠法觀察獲取轉(zhuǎn)錄組dna的目的片段,pcr法、ta克隆等方法檢驗擴增建庫水平,探討通過以上方法進行微量細胞建庫的可行性與效率。對比aga前額組(脫發(fā)臨界)、aga枕后組、正常男性枕后組、正常女性枕后組的基因表達譜分析,將進一步揭示aga發(fā)病的毛囊干細胞機制,為開發(fā)aga的新型靶向治療方案奠定基礎(chǔ)。【結(jié)果】(1)通過測量毛囊單位的生長期毛囊數(shù)量以及生長期毛囊的長度發(fā)現(xiàn),aga前額組(脫發(fā)臨界)毛囊的長度小于aga枕后部毛囊的長度(p=0.0014);aga枕后部毛囊的長度小于正常男性枕后部、正常女性枕后部毛囊的長度(p0.0001);而正常男性枕后組與正常女性枕后組無明顯差異。aga前額部毛囊單位內(nèi)生長期毛囊的根數(shù)比aga枕部(p=0.0005),正常男性枕部(p0.001)以及正常女性枕部(p0.001)都少,但其余三組之間無明顯差異。(2)分別從毛囊的結(jié)構(gòu)、干細胞、增殖等方面進行對比分析:CK14結(jié)構(gòu)蛋白染色未見四個實驗組毛囊之間結(jié)構(gòu)存在明顯差異;AGA枕后區(qū)、正常男性枕后區(qū)及正常女性枕后區(qū)的CD200表達均位于毛囊隆突區(qū)位置,并且表達較強,AGA前額區(qū)隆突區(qū)域也明顯有CD200的陽性表達,但較其他組明顯減弱;AGA枕后組、正常男性枕后組、正常女性枕后組的Ki67陽性表達主要分布在毛球部上方、毛囊下1/4至1/5處,且其的表達量不高,與正常表皮的增殖情況一致。而AGA前額組(脫發(fā)臨界)的Ki67陽性表達量明顯上調(diào),且表達位置分布高至毛囊下1/2處,較其他組位置明顯增高。(3)以人頭皮毛囊為實驗材料時,同時選擇“顯微分離技術(shù)-酶消化”法作為標準化毛囊模型的的制備方法,這種方法制備的毛囊模型結(jié)構(gòu)完整、純度高、損傷小。(4)通過顯微分離技術(shù)、酶消化與免疫磁珠聯(lián)合法獲取的毛囊干細胞經(jīng)過流式細胞儀分析、細胞涂片法染色等方法進行系統(tǒng)評價,發(fā)現(xiàn)這種分離純化毛囊干細胞的策略能進一步純化毛囊干細胞,細胞損失率降低。(5)以構(gòu)建的毛囊標準化模型為基礎(chǔ)獲得的細胞組群進行細胞含量分析,四個實驗組毛囊內(nèi)所含CD200百分比個體差異較大,有可能因為個體差異造成。但每個AGA患者自身比較發(fā)現(xiàn),其枕后部毛囊CD200百分比含量均高于其前額部。(6)通過AGA前額組(脫發(fā)臨界)、AGA枕后組、正常男性枕后組、正常女性枕后組四組間的基因表達譜分析,發(fā)現(xiàn)AGA枕后組基因表達譜與AGA前額(脫發(fā)臨界)組相近,與其他正常組差異明顯。說明AGA枕后區(qū)雖然不表現(xiàn)脫發(fā)病變,但它仍存在某些顯著缺陷�！窘Y(jié)論】(1)AGA患者前額組(脫發(fā)臨界)明顯出現(xiàn)生長期毛囊減少,毛囊形狀變細、變短。而AGA枕后組較正常人(男、女)也出現(xiàn)了明顯的縮短。(2)AGA前額組(脫發(fā)臨界)CD200干細胞表達量明顯減少,增殖細胞Ki67明顯增多。(3)選擇“顯微分離技術(shù)-酶消化”法作為標準化毛囊模型的的制備方法,這種方法制備的毛囊模型結(jié)構(gòu)完整、純度高、損傷小。(4)通過顯微分離技術(shù)、酶消化與免疫磁珠聯(lián)合法獲取的毛囊干細胞能進一步純化毛囊干細胞,細胞損失率降低。(5)AGA枕后組基因表達譜與AGA前額(脫發(fā)臨界)組相近,而與其他正常組差異明顯。AGA枕后組也存在某些嚴重缺陷。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R758.71

【參考文獻】

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本文編號：2275220