【摘要】：【研究背景】男性脫發(fā)癥(AGA)是世界上最常見的皮膚疾病之一,困擾著我國超過1億的成年男性。且其發(fā)病率隨著我國社會(huì)生活的快節(jié)奏化和人口老齡化,而呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。已知AGA的主要誘因是雄激素雙氫睪酮(DHT)體內(nèi)濃度改變。另外遺傳背景、營養(yǎng)狀況、精神壓力、衰老程度、免疫反應(yīng)、外來損傷等因素也在AGA發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。但這種疾病的具體發(fā)病機(jī)制至今仍不完全清楚。目前臨床上可用于治療AGA的藥物僅有抑制DHT生成的Finasteride和血管擴(kuò)張劑Minoxidil兩種。前者有影響男性性功能的潛在副作用,后者在停藥后會(huì)導(dǎo)致更為嚴(yán)重的脫發(fā),在臨床上均難以實(shí)現(xiàn)理想的療效。而開發(fā)更為有效的AGA治療方法將需要我們深入解析AGA的發(fā)病機(jī)制,并開發(fā)其針對(duì)性的干預(yù)手段。男性脫發(fā)具有較為固定的發(fā)展模式。一般前額與頭頂部最先禿發(fā),而枕后部區(qū)域的毛發(fā)則保持生長。將枕后部毛囊移植到前額禿發(fā)區(qū)仍可正常生長毛發(fā),提示毛發(fā)生長停滯的根本原因在于毛囊自身而非其周邊環(huán)境(20世紀(jì)50年代提出的“優(yōu)勢(shì)供區(qū)”理論)。毛發(fā)生長由毛囊內(nèi)部的毛囊干細(xì)胞驅(qū)動(dòng),并隨著這些干細(xì)胞在激活與靜止?fàn)顟B(tài)之間的來回切換而呈現(xiàn)出生長-退行-休止的周期性循環(huán)。在AGA的發(fā)病過程中毛囊逐步萎縮,生長期縮短,休止期延長,最終失去再生毛發(fā)的能力。但我們對(duì)毛囊干細(xì)胞在這個(gè)疾病過程中的病理轉(zhuǎn)變過程及其機(jī)制仍然缺乏了解。有研究顯示脫發(fā)區(qū)域中的毛囊干細(xì)胞并未消失,只是處于異常的休止?fàn)顟B(tài)而無法產(chǎn)生毛發(fā)。而闡明這種異常休止?fàn)顟B(tài)的分子機(jī)制將為其針對(duì)性治療方案的開發(fā)提供線索。既往文獻(xiàn)中對(duì)AGA的病理學(xué)分析多基于禿發(fā)頭皮與健康頭皮的直接對(duì)比。但完全禿發(fā)區(qū)域的毛囊往往存在結(jié)構(gòu)異常、脂溢、感染、發(fā)炎等現(xiàn)象。不易區(qū)分導(dǎo)致脫發(fā)的直接病理因素與次生現(xiàn)象,也未能闡明毛囊干細(xì)胞在AGA發(fā)展過程中的病理轉(zhuǎn)變過程。在本課題中,為了深入闡明毛囊干細(xì)胞在AGA發(fā)病中的病理轉(zhuǎn)變過程及其分子機(jī)制,本人將從脫發(fā)癥患者前額脫發(fā)區(qū)邊緣剛開始毳毛化但尚未完全禿發(fā)的臨界區(qū)域中收集毛囊樣品,并與來自同一患者的枕后部未脫發(fā)區(qū)頭皮及健康人頭皮的毛囊樣品進(jìn)行對(duì)比分析,解析它們?cè)谛螒B(tài)結(jié)構(gòu)以及其中毛囊干細(xì)胞數(shù)量、位置、增殖、分化上的差異。隨后,本人還將開發(fā)一套從人類毛囊樣品中分離純化毛囊干細(xì)胞的有效技術(shù)手段,并在國際上首次嘗試對(duì)脫發(fā)臨界區(qū)及對(duì)照區(qū)域的毛囊干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組比較分析。通過這些研究,我將進(jìn)一步揭示AGA發(fā)病的毛囊干細(xì)胞機(jī)制,為開發(fā)AGA的新型靶向治療方案奠定基礎(chǔ)。【目的】(1)對(duì)比aga脫發(fā)臨界區(qū)、枕后區(qū)以及正常人群枕后區(qū)的毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)及其中的毛囊干細(xì)胞數(shù)量、位置、增殖、分化之間的差異。(2)建立從頭皮樣品中分離純化人類毛囊干細(xì)胞的技術(shù)體系。(3)建立對(duì)微量毛囊細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)體系,并轉(zhuǎn)錄組分析探索aga脫發(fā)臨界毛囊干細(xì)胞與正常毛囊干細(xì)胞的基因表達(dá)差異�！痉椒ā�(1)對(duì)aga人群脫發(fā)臨界區(qū)、枕后區(qū)與正常人群(男、女)枕后區(qū)的毛囊進(jìn)行解剖觀察不同毛囊組間的形態(tài)學(xué)差異,測(cè)量毛囊單位的生長期毛囊數(shù)量以及生長期毛囊的長度;通過對(duì)不同組間毛囊進(jìn)行免疫組化分析,分別從毛囊的結(jié)構(gòu)、干細(xì)胞、增殖等方面進(jìn)行對(duì)比分析,獲得病變與正常毛囊的基本數(shù)據(jù),旨在能系統(tǒng)性分析病變與正常毛囊間的大體存在的差異性。(2)擬以顯微操作與酶消化法相聯(lián)合,通過dispaseii分散酶從皮膚中分離毛囊,構(gòu)建一個(gè)毛囊模型。對(duì)所構(gòu)建的毛囊模型分別進(jìn)行he染色、免疫組化實(shí)驗(yàn),觀察毛囊結(jié)構(gòu),驗(yàn)證毛囊模型的純度及完整性。通過構(gòu)建毛囊模型,進(jìn)一步比較aga臨界毛囊、aga枕后毛囊與正常人毛囊的干細(xì)胞含量的差異。同時(shí)通過磁珠免疫法進(jìn)一步純化毛囊細(xì)胞,為純化分離毛囊干細(xì)胞提供一種新的方法,并驗(yàn)證此方法的切實(shí)可行性。(3)擬以repli-gwtasinglecellkit擴(kuò)增毛囊微量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組基因,nebnextdnalibraryprepmastermixsetforillumina試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增后dna建庫。通過nano分光光度計(jì)、跑膠法觀察獲取轉(zhuǎn)錄組dna的目的片段,pcr法、ta克隆等方法檢驗(yàn)擴(kuò)增建庫水平,探討通過以上方法進(jìn)行微量細(xì)胞建庫的可行性與效率。對(duì)比aga前額組(脫發(fā)臨界)、aga枕后組、正常男性枕后組、正常女性枕后組的基因表達(dá)譜分析,將進(jìn)一步揭示aga發(fā)病的毛囊干細(xì)胞機(jī)制,為開發(fā)aga的新型靶向治療方案奠定基礎(chǔ)�！窘Y(jié)果】(1)通過測(cè)量毛囊單位的生長期毛囊數(shù)量以及生長期毛囊的長度發(fā)現(xiàn),aga前額組(脫發(fā)臨界)毛囊的長度小于aga枕后部毛囊的長度(p=0.0014);aga枕后部毛囊的長度小于正常男性枕后部、正常女性枕后部毛囊的長度(p0.0001);而正常男性枕后組與正常女性枕后組無明顯差異。aga前額部毛囊單位內(nèi)生長期毛囊的根數(shù)比aga枕部(p=0.0005),正常男性枕部(p0.001)以及正常女性枕部(p0.001)都少,但其余三組之間無明顯差異。(2)分別從毛囊的結(jié)構(gòu)、干細(xì)胞、增殖等方面進(jìn)行對(duì)比分析:CK14結(jié)構(gòu)蛋白染色未見四個(gè)實(shí)驗(yàn)組毛囊之間結(jié)構(gòu)存在明顯差異;AGA枕后區(qū)、正常男性枕后區(qū)及正常女性枕后區(qū)的CD200表達(dá)均位于毛囊隆突區(qū)位置,并且表達(dá)較強(qiáng),AGA前額區(qū)隆突區(qū)域也明顯有CD200的陽性表達(dá),但較其他組明顯減弱;AGA枕后組、正常男性枕后組、正常女性枕后組的Ki67陽性表達(dá)主要分布在毛球部上方、毛囊下1/4至1/5處,且其的表達(dá)量不高,與正常表皮的增殖情況一致。而AGA前額組(脫發(fā)臨界)的Ki67陽性表達(dá)量明顯上調(diào),且表達(dá)位置分布高至毛囊下1/2處,較其他組位置明顯增高。(3)以人頭皮毛囊為實(shí)驗(yàn)材料時(shí),同時(shí)選擇“顯微分離技術(shù)-酶消化”法作為標(biāo)準(zhǔn)化毛囊模型的的制備方法,這種方法制備的毛囊模型結(jié)構(gòu)完整、純度高、損傷小。(4)通過顯微分離技術(shù)、酶消化與免疫磁珠聯(lián)合法獲取的毛囊干細(xì)胞經(jīng)過流式細(xì)胞儀分析、細(xì)胞涂片法染色等方法進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)這種分離純化毛囊干細(xì)胞的策略能進(jìn)一步純化毛囊干細(xì)胞,細(xì)胞損失率降低。(5)以構(gòu)建的毛囊標(biāo)準(zhǔn)化模型為基礎(chǔ)獲得的細(xì)胞組群進(jìn)行細(xì)胞含量分析,四個(gè)實(shí)驗(yàn)組毛囊內(nèi)所含CD200百分比個(gè)體差異較大,有可能因?yàn)閭�(gè)體差異造成。但每個(gè)AGA患者自身比較發(fā)現(xiàn),其枕后部毛囊CD200百分比含量均高于其前額部。(6)通過AGA前額組(脫發(fā)臨界)、AGA枕后組、正常男性枕后組、正常女性枕后組四組間的基因表達(dá)譜分析,發(fā)現(xiàn)AGA枕后組基因表達(dá)譜與AGA前額(脫發(fā)臨界)組相近,與其他正常組差異明顯。說明AGA枕后區(qū)雖然不表現(xiàn)脫發(fā)病變,但它仍存在某些顯著缺陷�！窘Y(jié)論】(1)AGA患者前額組(脫發(fā)臨界)明顯出現(xiàn)生長期毛囊減少,毛囊形狀變細(xì)、變短。而AGA枕后組較正常人(男、女)也出現(xiàn)了明顯的縮短。(2)AGA前額組(脫發(fā)臨界)CD200干細(xì)胞表達(dá)量明顯減少,增殖細(xì)胞Ki67明顯增多。(3)選擇“顯微分離技術(shù)-酶消化”法作為標(biāo)準(zhǔn)化毛囊模型的的制備方法,這種方法制備的毛囊模型結(jié)構(gòu)完整、純度高、損傷小。(4)通過顯微分離技術(shù)、酶消化與免疫磁珠聯(lián)合法獲取的毛囊干細(xì)胞能進(jìn)一步純化毛囊干細(xì)胞,細(xì)胞損失率降低。(5)AGA枕后組基因表達(dá)譜與AGA前額(脫發(fā)臨界)組相近,而與其他正常組差異明顯。AGA枕后組也存在某些嚴(yán)重缺陷。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R758.71

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2275220