【摘要】：第一部分DKK1和β-catenin在人黑素瘤中的表達(dá)及意義 目的 研究DKK1和β-catenin在人原位惡性黑素瘤組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移惡性黑素瘤組織、正常人表皮組織中的表達(dá),探討DKK1在惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其與經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的相關(guān)性。 方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)DKK1和β-catenin在人原位惡性黑素瘤組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移惡性黑素瘤組織和正常人表皮組織中的表達(dá)。 結(jié)果 (1) DKK1在惡性黑素瘤組織中的表達(dá)低于正常人表皮組織。 (2) DKK1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移惡性黑素瘤組織中的表達(dá)低于原位惡性黑素瘤組織。 (3)β-catenin在惡性黑素瘤組織中的表達(dá)高于正常人表皮組織。 (4)β-catenin在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移惡性黑素瘤中的表達(dá)高于原位惡性黑素瘤組織。 結(jié)論 (1) DKK1在正常人表皮中表達(dá)較高,而在惡性黑素瘤中的表達(dá)減少,從而推測(cè)DKK1在惡性黑素瘤的發(fā)生中起一定作用。 (2) DKK1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移惡性黑素瘤中的表達(dá)低于原位惡性黑素瘤,從而推測(cè)DKK1與惡性黑素瘤惡性程度呈負(fù)相關(guān)。 (3)β-catenin在惡性黑素瘤中表達(dá)較高,而在正常人表皮中的表達(dá)減少,推測(cè)DKK1可能通過(guò)調(diào)控β-catenin的表達(dá),從而在惡性黑素瘤的發(fā)生中發(fā)揮作用。 (4)β-catenin在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移惡性黑素瘤中的表達(dá)高于原位惡性黑素瘤,從而推測(cè)β-catenin與惡性黑素瘤惡性程度呈正相關(guān)。 第二部分Ad-DKK1重組腺病毒載體的構(gòu)建 目的 構(gòu)建高表達(dá)目的基因DKK1重組腺病毒質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞HEK293,得到高滴度的腺病毒感染液。 方法 通過(guò)同源重組的方法構(gòu)建表達(dá)目的基因DKK1的腺病毒質(zhì)粒,首先通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增含有接頭的目的基因片斷DKK1,定向克隆進(jìn)入腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrack-TO4,再轉(zhuǎn)入含有腺病毒骨架質(zhì)粒Adeasy -1的感受態(tài)細(xì)菌BJ-Adeasy中,同源重組產(chǎn)生腺病毒質(zhì)粒Ad-DKK1,最終進(jìn)入包裝細(xì)胞HEK293,經(jīng)過(guò)乒乓交互感染收獲高滴度病毒感染液。 結(jié)果 (1)重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶PacⅠ酶切鑒定,DNA電泳,結(jié)果Ad-DKK1顯示:4.5kb大小的條帶,與預(yù)期結(jié)果吻合,說(shuō)明重組腺病毒Ad-DKK1構(gòu)建成功。 (2)熒光顯微鏡下觀察,Ad-DKK1腺病毒感染人黑素瘤細(xì)胞A375,大量細(xì)胞均可見(jiàn)綠色熒光。 (3)通過(guò)乒乓交互感染,收獲高滴度的Ad-DKK1病毒感染液。 (4) RT-PCR檢測(cè)DKK1 mRNA表達(dá),感染了Ad-DKK1人黑素瘤細(xì)胞A375中DKK1 mRNA水平明顯高于對(duì)照組(P0. 05)。 (5) Western-blot檢測(cè)DKK1蛋白表達(dá),感染了Ad-DKK1的人黑素瘤細(xì)胞A375中DKK1蛋白水平明顯高于對(duì)照組(P0. 05)。 結(jié)論 (1)經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定,成功構(gòu)建了高表達(dá)DKK1的Ad-DKK1的同源重組腺病毒。 (2)熒光顯微鏡下觀察,穩(wěn)定感染了Ad-DKK1腺病毒的A375可見(jiàn)大量綠色熒光。 (3)運(yùn)用RT-PCR和Western-blot實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了感染Ad-DKK1同源重組腺病毒的A375中DKK1的表達(dá)明顯增高。 第三部分DKK1對(duì)人黑素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 目的 差異表達(dá)DKK1后,研究其對(duì)A375細(xì)胞的增殖、侵襲和粘附能力的影響,并探討在A375細(xì)胞中DKK1是否通過(guò)調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路而發(fā)揮作用。 方法 (1)通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn),觀察差異表達(dá)DKK1后A375細(xì)胞的增殖能力的改變。 (2)運(yùn)用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn),觀察差異表達(dá)DKK1后A375細(xì)胞的侵襲能力的改變。 (3)運(yùn)用腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn),觀察差異表達(dá)DKK1對(duì)A375細(xì)胞粘附能力的影響。 (4)通過(guò)PCR方法觀察差異表達(dá)DKK1后A375細(xì)胞中β-catenin表達(dá)的變化。 結(jié)果 (1)高表達(dá)DKK1的A375組,細(xì)胞計(jì)數(shù)、克隆形成率及MTT吸光度值均小于對(duì)照組(P0.05),沉默DKK1的A375組細(xì)胞計(jì)數(shù)、克隆形成率及MTT吸光度值均大于對(duì)照組(P0.05)。 (2)高表達(dá)DKK1的A375細(xì)胞在Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)中,穿膜細(xì)胞數(shù)為56±6個(gè),比對(duì)照組明顯減少(P0.05),在劃痕實(shí)驗(yàn)中,36小時(shí)后劃痕間隙最寬;沉默DKK1的A375細(xì)胞在Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)中,穿膜細(xì)胞數(shù)為148±14個(gè),比對(duì)照組明顯增多(P0.05),在劃痕實(shí)驗(yàn)中,36小時(shí)后劃痕間隙最早消失。 (3)高表達(dá)DKK1的A375細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力較對(duì)照組下降(P0.05),而沉默DKK1的A375細(xì)胞粘附能力較對(duì)照組增強(qiáng)(P0.05)。 (4)高表達(dá)DKK1的A375細(xì)胞中,β-catenin mRNA水平較對(duì)照組明顯下降(P0.05),在沉默DKK1的A375細(xì)胞中,β-catenin mRNA水平較對(duì)照組明顯增高(P0.05)。 結(jié)論 (1) DKK1能夠抑制A375細(xì)胞增殖,而沉默DKK1可以促進(jìn)A375細(xì)胞增殖。 (2) DKK1抑制A375細(xì)胞侵襲和遷移,而沉默DKK1能促進(jìn)A375細(xì)胞侵襲和遷移。 (3) DKK1能抑制A375細(xì)胞粘附,而沉默DKK1能增強(qiáng)A375細(xì)胞粘附能力。 (4)在A375細(xì)胞中,DKK1通過(guò)抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中的β-catenin的表達(dá),從而發(fā)揮其抑制作用。 第四部分DKK1對(duì)人黑素瘤細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤生長(zhǎng)的影響 目的 研究差異表達(dá)A375細(xì)胞中DKK1后,對(duì)裸鼠皮下種植瘤生長(zhǎng)的影響。 方法 將差異表達(dá)DKK1的A375細(xì)胞和對(duì)照組A375細(xì)胞分別接種到裸鼠背部皮下,定時(shí)測(cè)量腫瘤體積,繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。裸鼠處死后,完整剝離瘤體,稱取瘤體重量,并將腫瘤固定于4%多聚甲醛,石蠟包埋,切片。切片用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)DKK1和β-catenin的表達(dá)水平。 結(jié)果 (1)高表達(dá)DKK1的A375組,腫瘤的體積、重量和生長(zhǎng)速度明顯低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 (2)沉默DKK1的A375組,腫瘤的體積、重量和生長(zhǎng)速度明顯大于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 (3)免疫組化顯示,高表達(dá)DKK1的A375組,DKK1的表達(dá)明顯高于對(duì)照組,沉默DKK1的A375組,DKK1的表達(dá)顯著低于對(duì)照組。 (4)免疫組化顯示,高表達(dá)DKK1的A375組,β-catenin蛋白的表達(dá)明顯低于對(duì)照組,沉默DKK1的A375組,β-catenin蛋白的表達(dá)顯著高于對(duì)照組。 結(jié)論 (1) DKK1能夠抑制A375細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤的生長(zhǎng)。 (2)沉默DKK1的表達(dá)能促進(jìn)A375細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤的生長(zhǎng)。 (3) DKK1通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路下游β-catenin的表達(dá),從而調(diào)節(jié)A375細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤的生長(zhǎng)。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R739.5

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 邢倩;高永良;陳瑾;;DKK1和β-catenin在尋常型銀屑病中的表達(dá)[J];激光雜志;2012年02期

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本文編號(hào)：2264989