發(fā)布時間：2018-10-11 19:32

【摘要】：第一部分DKK1和β-catenin在人黑素瘤中的表達及意義 目的 研究DKK1和β-catenin在人原位惡性黑素瘤組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移惡性黑素瘤組織、正常人表皮組織中的表達,探討DKK1在惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其與經(jīng)典Wnt信號通路的相關(guān)性。 方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測DKK1和β-catenin在人原位惡性黑素瘤組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移惡性黑素瘤組織和正常人表皮組織中的表達。 結(jié)果 (1) DKK1在惡性黑素瘤組織中的表達低于正常人表皮組織。 (2) DKK1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移惡性黑素瘤組織中的表達低于原位惡性黑素瘤組織。 (3)β-catenin在惡性黑素瘤組織中的表達高于正常人表皮組織。 (4)β-catenin在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移惡性黑素瘤中的表達高于原位惡性黑素瘤組織。 結(jié)論 (1) DKK1在正常人表皮中表達較高,而在惡性黑素瘤中的表達減少,從而推測DKK1在惡性黑素瘤的發(fā)生中起一定作用。 (2) DKK1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移惡性黑素瘤中的表達低于原位惡性黑素瘤,從而推測DKK1與惡性黑素瘤惡性程度呈負相關(guān)。 (3)β-catenin在惡性黑素瘤中表達較高,而在正常人表皮中的表達減少,推測DKK1可能通過調(diào)控β-catenin的表達,從而在惡性黑素瘤的發(fā)生中發(fā)揮作用。 (4)β-catenin在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移惡性黑素瘤中的表達高于原位惡性黑素瘤,從而推測β-catenin與惡性黑素瘤惡性程度呈正相關(guān)。 第二部分Ad-DKK1重組腺病毒載體的構(gòu)建 目的 構(gòu)建高表達目的基因DKK1重組腺病毒質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染包裝細胞HEK293,得到高滴度的腺病毒感染液。 方法 通過同源重組的方法構(gòu)建表達目的基因DKK1的腺病毒質(zhì)粒,首先通過PCR的方法擴增含有接頭的目的基因片斷DKK1,定向克隆進入腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrack-TO4,再轉(zhuǎn)入含有腺病毒骨架質(zhì)粒Adeasy -1的感受態(tài)細菌BJ-Adeasy中,同源重組產(chǎn)生腺病毒質(zhì)粒Ad-DKK1,最終進入包裝細胞HEK293,經(jīng)過乒乓交互感染收獲高滴度病毒感染液。 結(jié)果 (1)重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶PacⅠ酶切鑒定,DNA電泳,結(jié)果Ad-DKK1顯示:4.5kb大小的條帶,與預(yù)期結(jié)果吻合,說明重組腺病毒Ad-DKK1構(gòu)建成功。 (2)熒光顯微鏡下觀察,Ad-DKK1腺病毒感染人黑素瘤細胞A375,大量細胞均可見綠色熒光。 (3)通過乒乓交互感染,收獲高滴度的Ad-DKK1病毒感染液。 (4) RT-PCR檢測DKK1 mRNA表達,感染了Ad-DKK1人黑素瘤細胞A375中DKK1 mRNA水平明顯高于對照組(P0. 05)。 (5) Western-blot檢測DKK1蛋白表達,感染了Ad-DKK1的人黑素瘤細胞A375中DKK1蛋白水平明顯高于對照組(P0. 05)。 結(jié)論 (1)經(jīng)酶切和測序鑒定,成功構(gòu)建了高表達DKK1的Ad-DKK1的同源重組腺病毒。 (2)熒光顯微鏡下觀察,穩(wěn)定感染了Ad-DKK1腺病毒的A375可見大量綠色熒光。 (3)運用RT-PCR和Western-blot實驗,驗證了感染Ad-DKK1同源重組腺病毒的A375中DKK1的表達明顯增高。 第三部分DKK1對人黑素瘤細胞生物學(xué)行為的影響 目的 差異表達DKK1后,研究其對A375細胞的增殖、侵襲和粘附能力的影響,并探討在A375細胞中DKK1是否通過調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路而發(fā)揮作用。 方法 (1)通過細胞計數(shù)、細胞平板克隆形成實驗和MTT實驗,觀察差異表達DKK1后A375細胞的增殖能力的改變。 (2)運用Transwell小室侵襲實驗和劃痕實驗,觀察差異表達DKK1后A375細胞的侵襲能力的改變。 (3)運用腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)粘附實驗,觀察差異表達DKK1對A375細胞粘附能力的影響。 (4)通過PCR方法觀察差異表達DKK1后A375細胞中β-catenin表達的變化。 結(jié)果 (1)高表達DKK1的A375組,細胞計數(shù)、克隆形成率及MTT吸光度值均小于對照組(P0.05),沉默DKK1的A375組細胞計數(shù)、克隆形成率及MTT吸光度值均大于對照組(P0.05)。 (2)高表達DKK1的A375細胞在Transwell小室侵襲實驗中,穿膜細胞數(shù)為56±6個,比對照組明顯減少(P0.05),在劃痕實驗中,36小時后劃痕間隙最寬;沉默DKK1的A375細胞在Transwell小室侵襲實驗中,穿膜細胞數(shù)為148±14個,比對照組明顯增多(P0.05),在劃痕實驗中,36小時后劃痕間隙最早消失。 (3)高表達DKK1的A375細胞與細胞外基質(zhì)的粘附能力較對照組下降(P0.05),而沉默DKK1的A375細胞粘附能力較對照組增強(P0.05)。 (4)高表達DKK1的A375細胞中,β-catenin mRNA水平較對照組明顯下降(P0.05),在沉默DKK1的A375細胞中,β-catenin mRNA水平較對照組明顯增高(P0.05)。 結(jié)論 (1) DKK1能夠抑制A375細胞增殖,而沉默DKK1可以促進A375細胞增殖。 (2) DKK1抑制A375細胞侵襲和遷移,而沉默DKK1能促進A375細胞侵襲和遷移。 (3) DKK1能抑制A375細胞粘附,而沉默DKK1能增強A375細胞粘附能力。 (4)在A375細胞中,DKK1通過抑制經(jīng)典Wnt信號通路中的β-catenin的表達,從而發(fā)揮其抑制作用。 第四部分DKK1對人黑素瘤細胞裸鼠皮下種植瘤生長的影響 目的 研究差異表達A375細胞中DKK1后,對裸鼠皮下種植瘤生長的影響。 方法 將差異表達DKK1的A375細胞和對照組A375細胞分別接種到裸鼠背部皮下,定時測量腫瘤體積,繪制腫瘤生長曲線。裸鼠處死后,完整剝離瘤體,稱取瘤體重量,并將腫瘤固定于4%多聚甲醛,石蠟包埋,切片。切片用于免疫組織化學(xué)檢測DKK1和β-catenin的表達水平。 結(jié)果 (1)高表達DKK1的A375組,腫瘤的體積、重量和生長速度明顯低于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 (2)沉默DKK1的A375組,腫瘤的體積、重量和生長速度明顯大于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 (3)免疫組化顯示,高表達DKK1的A375組,DKK1的表達明顯高于對照組,沉默DKK1的A375組,DKK1的表達顯著低于對照組。 (4)免疫組化顯示,高表達DKK1的A375組,β-catenin蛋白的表達明顯低于對照組,沉默DKK1的A375組,β-catenin蛋白的表達顯著高于對照組。 結(jié)論 (1) DKK1能夠抑制A375細胞裸鼠皮下種植瘤的生長。 (2)沉默DKK1的表達能促進A375細胞裸鼠皮下種植瘤的生長。 (3) DKK1通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路下游β-catenin的表達,從而調(diào)節(jié)A375細胞裸鼠皮下種植瘤的生長。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R739.5

【引證文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 邢倩;高永良;陳瑾;;DKK1和β-catenin在尋常型銀屑病中的表達[J];激光雜志;2012年02期

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本文編號：2264989