【摘要】： 目的： 惡性黑色素瘤(malignant Melanoma, MM)是來源于黑色素細(xì)胞的高度惡性腫瘤,為人類第五大常見腫瘤,臨床常用的治療方法包括手術(shù)治療,化學(xué)治療,免疫治療等,這些方法雖然在臨床上取得了一定的療效,但是很難徹底治愈腫瘤。近年來,隨著癌基因和抑癌基因的相繼發(fā)現(xiàn),分子生物學(xué)手段的發(fā)展和完善,基因治療成為腫瘤治療研究中的熱點(diǎn),出現(xiàn)了多種基因治療方法。這些方法雖然都取得了一定的抑瘤效果,但療效并不理想。其主要原因是腫瘤是一個多因素、多環(huán)節(jié)、多階段的復(fù)雜疾病,針對單一因素的治療并不能根除腫瘤。因此,對現(xiàn)有治療方法的聯(lián)合成為基因治療研究的趨勢。本課題運(yùn)用基因聯(lián)合治療的方法治療小鼠惡性黑色素瘤,將活化小鼠特異性抗腫瘤免疫和抑制癌基因的表達(dá)兩種治療方法相聯(lián)合,觀察基因免疫治療聯(lián)合癌基因治療對惡性黑色素瘤的治療效果,為惡性黑色素瘤的治療提供新的策略。 方法： 構(gòu)建攜帶小鼠B7-H3基因的腺病毒表達(dá)載體(pAd-B7-H3)和攜帶小鼠Id-1短發(fā)夾RNA的慢病毒載體(Lent-Id 1-shRNA),通過體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行功能鑒定。將鼠B16惡性黑色素瘤細(xì)胞株接種于昆明小鼠皮下,構(gòu)建惡性黑色素瘤模型,并將小鼠隨機(jī)分為四組：①pAd-B7-H3+Lent-Id1-shRNA治療組：②pAd-B7-H3治療組；③Lent-Id1-shRNA治療組；④未行任何治療的小鼠作為未干預(yù)組。測量腫瘤直徑,記錄小鼠帶瘤生存時間,TUNEL法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡情況,比較各組間腫瘤體積、小鼠生存率和腫瘤細(xì)胞凋亡率的差異。 結(jié)果： 1.構(gòu)建重組腺病毒表達(dá)載體pAd-B7-H3,并獲得了滴度為2×1011pfu/ml的病毒。pAd-B7-H3轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組和pAd-CMV轉(zhuǎn)染組相比,B7-H3表達(dá)明顯升高(p0.05)。pAd-B7-H3轉(zhuǎn)染組細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)殺傷活性(31.932±2.800%),與未轉(zhuǎn)染組(16.027±2.847%)和pAd-CMV轉(zhuǎn)染組(16.417±2.492%)相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),而未干預(yù)組與pAd-CMV轉(zhuǎn)染組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),表明可以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。 2.構(gòu)建了三個攜帶Id-1短發(fā)夾RNA的慢病毒表達(dá)載體(Lent-Id1-shRNA 1#-3#), Western blot結(jié)果表明Lent-Id1-shRNA 1#對B16細(xì)胞中Id-1的抑制作用較強(qiáng)(p0.05)；MTT結(jié)果顯示,Lent-Id1-shRNA 1#具有較強(qiáng)的抑瘤效果(p0.05)。 3. pAd-B7-H3治療組、Lent-Id1-shRNA治療組與對照組相比腫瘤生長明顯減緩。接種28天后,pAd-B7-H3治療組腫瘤體積(2662.01±1909.67mm3)和pAd-CMV治療組(8226.89±4063.57 mm3)、未干預(yù)組(9656.65±5024.34 mm3)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),而pAd-CMV治療組和未干預(yù)組之間無明顯差異(p0.05)。Lent-Id1-shRNA治療組(2539.97±1564.71 mm3)和Lent-NC-GFP治療組(8783.29±3857.61mm3)、未干預(yù)組(9656.65±5024.34 mm3)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),而Lent-NC-GFP治療組和未干預(yù)組之間無明顯差異(p0.05)。 4. pAd-B7-H3+Lent-Id1-shRNA治療組腫瘤體積(144.67±252.37 mm3)明顯小于pAd-B7-H3治療組、Lent-Id1-shRNA治療組(p0.05)。 結(jié)論： 1.B7-H3疫苗和Lent-Id1-shRNA單獨(dú)治療昆明小鼠皮下惡性黑色素瘤,均能顯著抑制腫瘤的生長(約為未干預(yù)組腫瘤體積的2／3),但惡性黑色素瘤的治愈率為0。 2.B7-H3疫苗和Lent-Id1-shRNA聯(lián)合治療,可使惡性黑色素瘤的治愈率達(dá)到66.67%。聯(lián)合治療組中的未治愈者的帶瘤生存時間較單一治療明顯延長。B7-H3疫苗聯(lián)合沉默Id1基因?yàn)榕R床治療惡性黑色素瘤的治療提供了新的思路。
[Abstract]:Objective:
Malignant melanoma (MM) is a highly malignant tumor derived from melanocytes. It is the fifth most common tumor in human beings. The commonly used clinical treatment methods include surgery, chemotherapy, immunotherapy and so on. Although these methods have achieved some clinical effects, it is difficult to cure the tumor completely. The discovery of oncogenes and tumor suppressor genes successively, the development and perfection of molecular biological methods, gene therapy has become a hot spot in tumor therapy research, and a variety of gene therapy methods have emerged. Although these methods have achieved certain tumor suppressor effect, but the effect is not ideal. The main reason is that tumor is a multi-factor, multi-link, multi-stage. Therefore, the combination of current therapies has become the trend of gene therapy. In this study, we used gene therapy to treat malignant melanoma in mice, combining two therapies: activating specific anti-tumor immunity and suppressing oncogene expression. To observe the effect of gene immunotherapy combined with oncogene therapy on malignant melanoma and provide a new strategy for the treatment of malignant melanoma.
Method:
Adenovirus expression vector carrying mouse B7-H3 gene (pAd-B7-H3) and lentivirus vector carrying mouse Id-1 short hairpin RNA (Lent-Id-1-shRNA) were constructed and their functions were identified by in vitro and in vivo experiments. There were four groups: 1) pAd-B7-H3 + Lent-Id1-shRNA treatment group; 2) pAd-B7-H3 treatment group; 3) Lent-Id1-shRNA treatment group; 4) mice without any treatment as non-intervention group. Tumor diameter was measured, survival time was recorded, tumor cell apoptosis was detected by TUNEL, tumor volume, survival rate and tumor size were compared among the groups. The difference of apoptosis rate.
Result:
1. The recombinant adenovirus expression vector pAd-B7-H3 was constructed and the virus titer was 2 *1011 pfu/ml. The expression of B7-H3 in pAd-B7-H3 transfection group was significantly higher than that in non-transfection group and pAd-CMV transfection group (p0.05). Cytotoxic T lymphocyte (CTL) killing activity in pAd-B7-H3 transfection group (31.932 +2.800%) was higher than that in non-transfection group (16. There was a significant difference between the two groups (p0.05). There was no significant difference between the non-intervention group and the pAd-CMV transfection group (p0.05). It indicated that the specific cytotoxic T lymphocytes could be induced.
2. Three lentiviral expression vectors carrying Id-1 short hairpin RNA (Lent-Id1-shRNA 1#-3#) were constructed. Western blot results showed that Lent-Id1-shRNA 1# had a strong inhibitory effect on Id-1 in B16 cells (p0.05); MTT results showed that Lent-Id1-shRNA 1# had a strong inhibitory effect on tumor (p0.05).
3. The growth of tumor in pAd-B7-H3 treatment group, Lent-Id1-shRNA treatment group and control group was significantly slower than that in pAd-B7-H3 treatment group. After 28 days of inoculation, the tumor volume in pAd-B7-H3 treatment group (2662.01 +1909.67 mm3) and pAd-CMV treatment group (8226.89 +4063.57 mm3) were significantly different from that in non-intervention group (9656.65 +5024.34 mm3), but there were significant differences between pAd-CMV treatment group and non-intervention group (p0.05). There was no significant difference between Lent-Id1-shRNA treatment group (2539.97+1564.71 mm3) and Lent-NC-GFP treatment group (8783.29+3857.61 mm3) and non-intervention group (9656.65+5024.34 mm3), but there was no significant difference between Lent-NC-GFP treatment group and non-intervention group (p0.05).
4. The tumor volume of pAd-B7-H3+Lent-Id1-shRNA treatment group (144.67+252.37 mm3) was significantly smaller than that of pAd-B7-H3 treatment group and Lent-Id1-shRNA treatment group (p0.05).
Conclusion:
1. B7-H3 vaccine and Lent-Id1-shRNA alone can significantly inhibit the growth of subcutaneous malignant melanoma in Kunming mice (about 2/3 of the tumor volume of the non-intervention group), but the cure rate of malignant melanoma is 0.
B7-H3 vaccine combined with Lent-Id1-shRNA treatment can make the cure rate of malignant melanoma reach 66.67%. The survival time of incurable patients in the combined treatment group is significantly longer than that in the single treatment group. B7-H3 vaccine combined with silencing Id1 gene provides a new idea for clinical treatment of malignant melanoma.
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R739.5

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本文編號：2245085