發(fā)布時間：2018-08-07 18:41

【摘要】：目的: 構(gòu)建并鑒定Ang2基因的RNA干擾慢病毒表達(dá)載體,觀察其對惡性黑色素瘤細(xì)胞Ang2基因的干擾作用,為將來進(jìn)一步進(jìn)行裸鼠惡性黑色素瘤移植瘤生長的抑制實驗奠定基礎(chǔ),為腫瘤的基因治療提供實驗依據(jù)。 方法: 1、將重組質(zhì)粒pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切成所需要的目的片段U6-Ang2-siRNA,經(jīng)電泳鑒定后,與經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切電泳鑒定的pNL-EGFP載體連接,構(gòu)建pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒,電泳篩選陽性單克隆,測序鑒定。 2、將連接成功的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ,分別與包裝質(zhì)粒pHelper和包膜質(zhì)粒pVSVG組成慢病毒三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)[1、2],再共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,生產(chǎn)pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ慢病毒。 3、將收集的慢病毒上清按不同的濃度感染293T細(xì)胞,測定病毒原液的滴度。 4、將收集的病毒原液按不同的感染復(fù)數(shù)感染感染惡性黑色素瘤細(xì)胞,確定合適的感染復(fù)數(shù)。 5、在合適的感染復(fù)數(shù)的條件下,將收集的慢病毒感染惡性黑色素瘤細(xì)胞,通過實時熒光定量RT-PCR方法檢測惡性黑色素瘤細(xì)胞中Ang2基因的表達(dá)量,進(jìn)而得到RNAi沉默Ang2基因表達(dá)的效率。 結(jié)果: 1、酶切電泳表明限制性內(nèi)切酶XbaⅠ成功的從重組質(zhì)粒pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA中酶切出所需要的目的片段U6-Ang2-siRNA。 2、酶切電泳表明限制性內(nèi)切酶XbaⅠ成功酶切pNL-EGFP載體。 3、經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切后電泳鑒定及測序鑒定證實成功構(gòu)建了慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ。 4、利用三質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)成功的構(gòu)建了pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ慢病毒,收集慢病毒上清,并測得慢病毒滴度為8.0x103/ul。 5、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ慢病毒感染惡性黑色素瘤細(xì)胞,感染效率較高達(dá)94.6%,實時熒光定量RT-PCR的結(jié)果顯示:pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ慢病毒載體抑制了惡性黑色素瘤細(xì)胞中Ang2基因的表達(dá),抑制率為68.31%(P0.05),pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ慢病毒抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞中Ang2基因的表達(dá)效率低,抑制率為13.31%,且差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論:成功的利用三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)構(gòu)建了Ang2-SiRNA慢病毒載體,利用Ang2-SiRNA慢病毒載體體外感染惡性黑色素瘤細(xì)胞,感染效率較高,且能抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞的Ang2 mRNA的表達(dá),為下一步進(jìn)行裸鼠惡性黑色素瘤移植瘤生長的抑制實驗奠定基礎(chǔ),為腫瘤的基因治療提供實驗依據(jù)。
[Abstract]:Objective: to construct and identify the RNA interfering lentivirus expression vector of Ang2 gene and observe its interfering effect on Ang2 gene in malignant melanoma cells. It will lay a foundation for the further growth inhibition of malignant melanoma in nude mice and provide experimental basis for gene therapy of tumor. Methods: 1. The recombinant plasmid pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA was digested with restriction endonuclease Xba 鈪，

本文編號：2170996