【摘要】：一、目的:黑色素瘤惡性程度非常高,確診時已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有遠處轉移。已經(jīng)有研究證實,在黑色素瘤中上皮間質轉化和腫瘤的侵襲轉移關系密切。另外有研究表明縫隙連接蛋白Cx43和縫隙連接通訊功能的增強抑制惡性腫瘤的上皮間質轉化的過程。在腫瘤微環(huán)境中,腫瘤相關巨噬細胞的極性轉化及細胞因子的分泌促進腫瘤的上皮間質轉化。縫隙連接通訊功能提高時增加巨噬細胞的抗原遞呈能力,縫隙連接與免疫密切相關。在實驗室前期研究中發(fā)現(xiàn),薯蕷皂苷可以提高縫隙連接蛋白表達及通訊功能。本研究采用小鼠黑色素瘤B16細胞,腫瘤相關巨噻細胞RAW264.7細胞和C57BL/6小鼠作為研究對象,探討薯蕷皂苷在提高縫隙連接通訊功能的基礎上對小鼠黑色素瘤殺傷和轉移,以及在腫瘤相關巨噬細胞模型下薯蕷皂苷治療小鼠黑色素瘤的作用機制。二、方法:(1)薯蕷皂苷對縫隙連接蛋白及功能和上皮間質轉化的影響1、MTT法檢測0～8μM薯蕷皂苷對小鼠黑色素瘤B16細胞生長的影響,以確定用于研究后續(xù)實驗的Dio濃度。RT-PCR及Western bolt檢測Dio和RA對B16細胞Cx43基因和蛋白的影響,采用相對定量方法分析Cx43mRNA水平和蛋白水平,用免疫熒光的方法檢測Dio和RA治療B16細胞48 h后Cx43蛋白的表達。用激光共聚焦顯微鏡(Confocal)及流式細胞儀檢測Dio和RA作用B16細胞48 h后GJIC的功能。2、劃痕方法和transwell實驗檢測薯蕷皂苷對B16細胞侵襲和遷移能力的影響。3、AmpliteTM Universal Fluorimetric MMP Activity Assay Kit 試劑盒檢測薯蕷皂苷對MMPs活性的影響。4、Dio和RA對B16細胞治療48 h后,使用胰酶消化細胞后,收集消化下來的細胞,用RIPA加PMSF裂解細胞后提取處理過的總蛋白并且定量。采用Western bolt檢測上皮間質轉化蛋白 E-cadherin,N-cadherin,snail1,vimentin,β-catenin 及腫瘤干細胞蛋白sox-2,oct3/4,nanog的表達情況。(2)薯蕷皂苷抑制小鼠黑色素瘤轉移的機制探討1、Confocal檢測過表達Cx43和突變型Cx43質粒的轉染效率。Western bolt及免疫熒光的方法檢測過表達Cx43和突變型Cx43轉染48 h后Cx43蛋白的表達從而確定轉染是否成功。劃痕標記熒光染料示蹤技術檢測過表達Cx43和突變型Cx43轉染B16細胞24 h后熒光傳輸情況。從而確定質粒轉染后對細胞功能是否起作用。2、劃痕方法和transwell實驗檢測縫隙連接通訊功能改變對B16細胞侵襲和遷移能力的影響。3、AmpliteTM Universal Fluorimetric MMP Activity Assay Kit 試劑盒檢測縫隙連接縫隙連接通訊功能改變對MMPs活性的影響。4、Western bolt檢測過表達Cx43,突變型Cx43轉染48 h后,檢測上皮間質轉化蛋白 E-cadherin,N-cadherin,snaill,vimentin,β-catenin 的表達情況。5、在縫隙連接通訊功能被阻斷的B16細胞上給予薯蕷皂苷處理48 h后,檢測縫隙連接蛋白 Cx43,上皮間質轉化蛋白 E-cadherin,N-cadherin,snail1,vimentin,β-catenin的表達情況。6、薯蕷皂苷作用B16細胞48 h后,Western bolt檢測維甲酸受體蛋白RXRα,RARα,RARβ,RARγ的表達情況。(3)薯蕷皂苷對腫瘤相關巨噬細胞RAW264.7的作用1、MTT法檢測0～8 μM薯蕷皂苷對腫瘤相關巨噬細胞RAW264.7細胞殺傷的作用。薯蕷皂苷(1 μM及2 μM)對RAW264.7細胞治療48 h后,Western bolt檢測縫隙連接蛋白Cx43水平,激光共聚焦顯微鏡檢測薯蕷皂苷作用RAW264.7細胞48 h后與B16細胞共培養(yǎng)以及過表達Cx43和突變型Cx43作用RAW264.7細胞48 h后與B16細胞共培養(yǎng),巨噬細胞吞噬B16細胞的能力。2、流式細胞儀檢測薯蕷皂苷和脂多糖(LPS)作用RAW264.7細胞48h后,腫瘤相關巨噬細胞表型(F4/80),M1 型(CD68,CD86,NOSi),M2 型(CD206,CD209)變化。3、ELISA檢測薯蕷皂苷作用RAW264.7細胞48 h后,分泌細胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6變化。4、劃痕方法和transwell實驗檢測RAW264.7細胞條件培養(yǎng)液(薯蕷皂苷(0,1μM,2 μM)和LPS(1μg/mL)作用RAW264.7細胞48 h后,棄培養(yǎng)基更換新鮮無藥RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集培養(yǎng)基離心取上清即為條件培養(yǎng)液)作用小鼠黑色素瘤B16細胞對侵襲及遷移能力的影響。5、取條件培養(yǎng)液作用小鼠黑色素瘤B16細胞48 h后,提蛋白及定量。采用Western bolt檢測縫隙連接蛋白Cx43,上皮間質轉化蛋白E-cadherin,N-cadherin,snail1,vimentin,β-catenin及腫瘤干細胞蛋白sox-2,oct3/4,nanog的表達情況。(4)建立C57BL/6小鼠腫瘤轉移模型研究薯蕷皂苷對肺轉移的影響建立小鼠黑色素瘤B16細胞主動腫瘤轉移模型和腫瘤被動轉移模型,腫瘤主動轉移模型:將小鼠黑色素瘤B16細胞3×105個通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi),第二天開始隨機分組,實驗分組為模型組,低劑量組和高劑量組,每組C57BL/6的樣本量為10只,共30只。薯蕷皂苷開始灌胃給藥,每天給藥1次,給藥18天。腫瘤被動轉移模型:將小鼠黑色素瘤B16細胞4×105個接種到小鼠背部。當長出腫瘤時,隨機分組,實驗分組為模型組,低劑量組和高劑量組,每組C57BL/6的樣本量為12只共36只。以薯蕷皂苷30 mg/kg和60 mg/kg濃度開始灌胃給藥,每天給藥1次。給藥結束后,處死小鼠,取材一部分凍存于-80℃,一部分4%多聚甲醛固定。采用免疫組化的方法檢測縫隙連接蛋白Cx43,上皮間質轉化蛋白E-cadherin,N-cadherin的表達情況。三.結果:(1)薯蕷皂苷對縫隙連接蛋白及功能和上皮間質轉化的影響1、MTT結果顯示薯蕷皂苷對小鼠黑色素瘤B16細胞有殺傷作用,半數(shù)殺傷藥物濃度為4.21 μM。RT-PCR,Western bolt,激光共聚焦顯微鏡檢測薯蕷皂苷對B16的作用結果顯示,與空白對照組相比,薯蕷皂苷組上調(diào)縫隙連接Cx43的基因及蛋白水平的表達。Confocal及流式細胞儀檢測薯蕷皂苷對B16的作用48h后結果顯示,與空白對照組相比,隨著濃度的增加,薯蕷皂苷提高B16細胞的縫隙連接通訊功能。2、劃痕方法及transwell實驗檢測薯蕷皂苷對B16細胞的作用48 h后結果顯示,與空白對照組相比,隨著濃度的增加,薯蕷皂苷降低B16細胞的侵襲及遷移的能力。3、AmpliteTM Universal Fluorimetric MMP Activity Assay Kit 試劑盒檢測薯蕷皂苷對B16細胞的作用48 h結果顯示,與空白對照組相比,隨著濃度的增加,薯蕷皂苷能顯著性降低MMPs的活性。4、Western bolt檢測薯蕷皂苷作用B16細胞48 h結果顯示,與空白對照組相比,上皮間質轉化蛋白表達情況顯示,薯蕷皂苷能顯著上調(diào)E-cadherin的蛋白表達水平,下調(diào)N-cadherin,snail1,vimentin,β-catenin的蛋白表達水平。腫瘤干細胞蛋白表達情況顯示,隨著濃度的增加,薯蕷皂苷能顯著性降低oct3/4,sox-2及nanog表達水平。(2)薯蕷皂苷通過激活維甲酸受體通路來上調(diào)Cx43從而抑制腫瘤轉移1、用激光共聚焦顯微鏡檢測過表達及突變型Cx43的轉染效率為70%左右。瞬時轉染過表達及突變型Cx43質粒48 h后,采用免疫熒光及Western bolt的方法檢測結果顯示,質粒轉染成功能夠上調(diào)縫隙連接蛋白Cx43的表達。劃痕標記熒光染料示蹤技術檢測過表達Cx43和突變型Cx43轉染B16細胞24 h后,過表達Cx43增強B16的縫隙連接通訊功能,突變型Cx43阻斷縫隙連接通訊功能。2、劃痕及transwell實驗結果顯示,與空質粒組相比,過表達Cx43抑制B16細胞的侵襲和遷移能力,突變型Cx43增強B16細胞的侵襲和遷移能力。3、MMPs活性檢測試劑盒檢測過表達Cx43和突變型Cx43對B16細胞的作用結果顯示,與空質粒組相比,過表達Cx43能顯著性降低MMPs活性,突變型Cx43能顯著性提高MMPs活性。4、Western bolt檢測過表達Cx43和突變型Cx43對B16細胞的作用結果顯示,與空質粒組相比,上皮間質轉化蛋白表達情況顯示,過表達Cx43能顯著上調(diào)E-cadherin的蛋白表達水平,顯著下調(diào)snail1,vimentin的蛋白表達水平,同時下調(diào)N-cadherin,β-catenin表達水平,顯著性差異。與之相反,上皮間質轉化蛋白表達情況顯示,突變型Cx43能顯著下調(diào)E-cadherin的蛋白表達水平,顯著上調(diào)snail1,vimentin,N-cadherin,β-catenin 的蛋白表達水平。5、Western bolt檢測突變型Cx43的B16細胞薯蕷皂苷作用48 h結果顯示,與空質粒組相比,薯蕷皂苷能顯著上調(diào)正�？p隙連接蛋白Cx43蛋白的表達。與突變型Cx43組相比,薯蕷皂苷藥物作用后,隨濃度的增加,上皮間質轉化蛋白表達情況顯示,E-cadherin 的蛋白表達顯著上調(diào),snail1,vimentin,N-cadherin,β-catenin 的蛋白表達顯著下調(diào)。6、Western bolt檢測薯蕷皂苷作用B16細胞48 h后結果顯示,隨著濃度的增加,維甲酸受體蛋白RXRα表達顯著下降,RARα,RARβ,RARγ表達顯著升高。考慮薯蕷皂苷上調(diào)Cx43可能是通過維甲酸受體通路起作用。(3)薯蕷皂苷對腫瘤相關巨噬細胞的抗腫瘤作用1、MTT檢測薯蕷皂苷對RAW264.7細胞的生長作用,結果顯示,與空白組相比,薯蕷皂苷對RAW264.7細胞的殺傷作用不明顯。Western bolt檢測薯蕷皂苷作用于RAW264.7細胞48 h上調(diào)Cx43蛋白的表達。激光共聚焦顯微鏡檢測薯蕷皂苷處理RAW264.7細胞與B16細胞共培養(yǎng),結果顯示,隨著濃度增加,薯蕷皂苷增加RAW264.7細胞的吞噬能力。過表達Cx43與突變型Cx43分別與B16細胞共培養(yǎng)結果顯示,過表達Cx43增加RAW264.7細胞的吞噬能力,突變型Cx43降低RAW264.7細胞的吞噬能力,以上結果表明薯蕷皂苷通過上調(diào)Cx43提高RAW264.7細胞的吞噬能力。2、流式細胞儀檢測薯蕷皂苷作用于RAW264.7細胞48 h,結果顯示,與對照組相比,隨著濃度的增加,M1型標記物NOSi,CD86,CD68表達增加,M2型標記物CD206,CD209表達下降。薯蕷皂苷使RAW264.7細胞由M2型向M1型轉化。3、ELISA檢測薯蕷皂苷作用于RAW264.7細胞48 h,結果顯示,薯蕷皂苷上調(diào)細胞因子 TNF-α,IL-1β,IL-6。4、劃痕和transwell實驗檢測RAW264.7細胞條件培養(yǎng)液作用于B16細胞48 h后,結果顯示,與空白對照組相比,薯蕷皂苷組RAW264.7細胞培養(yǎng)液降低B16細胞的侵襲及遷移能力。5、Western bolt檢測RAW264.7細胞條件培養(yǎng)液作用于B16細胞48 h后結果顯示,與空白對照組相比,上皮間質轉化蛋白表達情況顯示,隨著濃度的增加,薯蕷皂苷組RAW264.7細胞培養(yǎng)液能顯著上調(diào)Cx43的蛋白表達,顯著上調(diào)E-cadherin的蛋白表達水平,下調(diào)N-cadherin,snail1,vimentin的蛋白表達水平,對β-catenin蛋白表達作用不明顯。腫瘤干細胞蛋白表達情況顯示,隨著濃度的增加,薯蕷皂苷組RAW264.7細胞培養(yǎng)液能顯著性降低sox-2,nanog,oct3/4蛋白表達水平。(4)在C57BL/6小鼠肺轉移模型中薯蕷皂苷抑制B16細胞肺轉移實驗過程中,各組C57BL/6小鼠的體重無顯著差異。腫瘤主動轉移模型及被動轉移模型結果顯示,與模型組相比隨著濃度的增加,薯蕷皂苷顯著抑制小鼠黑色素瘤B16細胞的肺轉移。免疫組化結果顯示,與模型組相比,薯蕷皂苷顯著上調(diào)Cx43,E-cadherin蛋白的表達;顯著降低N-cadherin蛋白的表達。四、結論:1、體外實驗中,通過上調(diào)Cx43可以阻抗黑色素瘤B16細胞的侵襲和轉移。薯蕷皂苷上調(diào)Cx43的表達及縫隙連接通訊功能且薯蕷皂苷抑制B16細胞的上皮間質轉化,薯蕷皂苷通過激活維甲酸受體通路上調(diào)Cx43來抑制小鼠黑色素瘤細胞B16細胞的上皮間質轉化。2、在腫瘤微環(huán)境中,腫瘤相關巨噬細胞占腫瘤微環(huán)境的30-50%,薯蕷皂苷通過上調(diào)Cx43蛋白的表達提高腫瘤相關巨噬細胞RAW264.7細胞的吞噬能力。薯蕷皂苷促使RAW264.7細胞由M2向M1轉化且促進炎性細胞因子的分泌。薯蕷皂苷作用RAW264.7細胞培養(yǎng)液上調(diào)Cx43表達,抑制上皮間質轉化蛋白表達,抑制腫瘤干細胞標志蛋白的表達。有可能通過上調(diào)Cx43蛋白抑制上皮間質轉化及腫瘤干細胞數(shù)。3、在體內(nèi)研究中,薯蕷皂苷能顯著抑制B16細胞的生長及肺轉移,通過上調(diào)Cx43抑制上皮間質轉化。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.5

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本文編號：2149298