本文選題：單核趨化因子蛋白-1 + 小鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞B16　； 參考：《鄭州大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景 惡性黑色素瘤（Malignant melanoma，MM）簡稱惡黑，是全世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，它起源于人類神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞，并由黑色素細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而來，它具有高度侵襲、高度轉(zhuǎn)移的特性。人類惡性黑色素瘤的發(fā)病率和死亡率在持續(xù)增長，因而日益受到人們的重視，且常規(guī)化療方法效果不佳，嚴(yán)重威脅著人類健康。其發(fā)病率在近20年成倍增長。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，人類惡性黑色素瘤的發(fā)病率占人類整體惡性腫瘤的3%，而人類皮膚惡性黑色素瘤的發(fā)病率占人類全部皮膚惡性腫瘤的7%～20%，并且其發(fā)病率每年仍以4%～6%速度增長。 人類皮膚惡性黑色素瘤是整形外科常見的體表腫瘤，它源于表皮正常黑色素細(xì)胞或正常痣細(xì)胞的一種惡性腫瘤，其惡性程度較高，進(jìn)展極為迅速，預(yù)后極差。人類皮膚惡性黑色素瘤的發(fā)病率和死亡率在過去30年內(nèi)每年遞增2%～3%，現(xiàn)在己引起人們高度重視。到目前為止，對人類惡性黑色素瘤的治療方法主要包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、生物治療以及腫瘤疫苗治療。目前，手術(shù)治療仍是最常用于人類惡性腫瘤治療的手段，特別是對許多早期局部發(fā)生的人類惡性黑色素瘤，手術(shù)治療有著良好的治療效果。在發(fā)生了彌漫性泛轉(zhuǎn)移或?qū)χ匾鞴俳䴘櫳L的惡性黑色素瘤，手術(shù)治療效果較差甚至無法進(jìn)行手術(shù)治療。治療手段主要是放療和化療，不過治療的效果并不容樂觀，主要是因其對常規(guī)放射治療及化學(xué)治療并不敏感，所以治療效果不肯定，同時(shí)放療及化療對正常組織也會有殺傷作用，這些副作用以及腫瘤耐藥性的產(chǎn)生等因素均會對化學(xué)治療的應(yīng)用產(chǎn)生較大的限制。生物學(xué)治療方面目前研究較多的主要有白介素、干擾素以及粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子等，不過目前尚無統(tǒng)一的用法可遵循�？偠灾�，應(yīng)用現(xiàn)有的治療手段治療人類惡性黑色素瘤還沒有十分令人滿意的方法。 這些年來，隨著分子生物學(xué)以及免疫學(xué)、生物化學(xué)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，人們逐漸對惡性腫瘤的生物學(xué)行為有了更進(jìn)一步的認(rèn)識。越來越多的人認(rèn)識到惡性腫瘤其實(shí)是一種基因相關(guān)性疾病，惡性腫瘤的細(xì)胞和人類正常組織的細(xì)胞既有同源性和相似性，又有異質(zhì)性。惡性腫瘤細(xì)胞主要通過免疫逃逸機(jī)制逃避機(jī)體的免疫清除，但是同時(shí)惡性腫瘤組織卻可產(chǎn)生與正常組織細(xì)胞不相同的免疫反應(yīng)過程。我們所說的腫瘤疫苗正是利用了腫瘤細(xì)胞的這一特點(diǎn)，對惡性腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷和清除，對正常組織細(xì)胞影響甚微。有一部分腫瘤疫苗已經(jīng)應(yīng)用于三期臨床研究，并已經(jīng)取得了令人振奮的進(jìn)展。 單核趨化因子蛋白1（monocyte chemoattractant protein1，MCP-1）又名CC趨化因子配體2（chemokine C-C motif ligand2，CCL2），屬于趨化因子CC家族成員之一。MCP-1是CC趨化因子家族之中最早被發(fā)現(xiàn)的，且研究得最多的成員之一。該因子可由多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生，例如白細(xì)胞、成骨細(xì)胞、單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、星形細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及一些腫瘤細(xì)胞等。MCP-1具有諸多功能，例如趨化調(diào)節(jié)單核細(xì)胞、NK細(xì)胞、記憶性T細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等往炎癥部位遷移、浸潤的功能。另外有研究顯示，MCP-1可通過與CC類趨化因子受體（CCR2）結(jié)合從而發(fā)揮多種生理作用，例如誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞以及NK細(xì)胞等細(xì)胞的活化、分化和發(fā)育等，同時(shí)還可參與血管的再生過程，這有利于腫瘤的生長或抑制功能，另外該因子還可增加巨噬細(xì)胞浸潤及巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的血管再生。這些年來，MCP-1的研究越來越多，尤其是其在細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制已經(jīng)成為該類研究的焦點(diǎn)。MCP-1屬于β類趨化因子，同樣具有一般CC家族趨化因子的結(jié)構(gòu)特征，另外其N端的氨基酸殘基形成螺旋結(jié)構(gòu)，這是MCP-1一級結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵部位，這在其識別受體及轉(zhuǎn)導(dǎo)信號中具有重要的作用。 近年來的研究重點(diǎn)除了應(yīng)用單純的自體或異體腫瘤細(xì)胞疫苗進(jìn)行治療，同時(shí)對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，或加用免疫佐劑以增加腫瘤細(xì)胞的免疫原性。因此，本課題擬以MCP-1基因?yàn)檠芯繉ο�，將該基因轉(zhuǎn)錄入野生型惡性黑色素瘤細(xì)胞株構(gòu)建基因修飾腫瘤疫苗，從免疫治療和基因治療兩方面共同探討惡性黑色素瘤治療方法，為人類惡性黑色素瘤的免疫治療提供一條新的途徑。 研究目的 構(gòu)建MCP-1的真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16從而構(gòu)建含有趨化因子MCP-1的小鼠惡性黑色素瘤疫苗，研究該疫苗在體外對淋巴細(xì)胞趨化作用；選用裸鼠作為實(shí)驗(yàn)動物，使用同型小鼠胸腺T移植重建裸鼠部分免疫功能，通過構(gòu)建該類裸鼠惡性黑色素瘤動物模型并研究該疫苗在體內(nèi)是否具有抗腫瘤活性，并初步探討及其發(fā)生機(jī)制。 研究方法 1.目的基因MCP-1的獲取 提取小鼠肝臟總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)GeneBank登錄的小鼠MCP-1cDNA序列（序列號為AF065929），利用Primer5設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)小鼠MCP-1引物。并對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。于1㳠瓊脂糖凝膠電泳1小時(shí)，UV燈下觀察擴(kuò)增片段。對目的片段進(jìn)行回收純化。 2.構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-MCP-1 制備感受態(tài)大腸桿菌，將目的基因轉(zhuǎn)化入載體質(zhì)粒pEGFP-N1，堿裂解法提取重組質(zhì)粒pEGFP-N1-MCP-1，并進(jìn)行酶切鑒定。 3.重組質(zhì)粒pEGFP-N1-MCP-1轉(zhuǎn)染裸鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞株B16 參照LipofectamineTM2000試劑盒使用說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分為三組：實(shí)驗(yàn)組、空載體對照組和空白對照組，每組做3個(gè)重復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組用4μL重組質(zhì)粒pEGFP-N1-MCP-1，空載體組加入等量的空質(zhì)粒pEGFP-N1，空白對照組加入等量的無菌PBS溶液。 4.轉(zhuǎn)染效果測定 轉(zhuǎn)染后48h對三組細(xì)胞進(jìn)行熒光顯微鏡觀察，通過觀察轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，從而判定轉(zhuǎn)染效果。 5.篩選穩(wěn)定表達(dá)MCP-1的細(xì)胞株B16-MCP-1 將小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16進(jìn)行G418篩選濃度的選擇，取轉(zhuǎn)染48h后的B16細(xì)胞，加初始篩選終濃度的G418進(jìn)行篩選，直至出現(xiàn)抗性克隆，對抗性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞的傳代及凍存以備后續(xù)試驗(yàn)使用。 6.重組細(xì)胞的鑒定及細(xì)胞增殖檢測 將篩選出來的抗性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)3周后，分別取各組細(xì)胞提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR，測定MCP-1轉(zhuǎn)錄情況，對重組細(xì)胞進(jìn)行鑒定。用ELISA方法檢測重組細(xì)胞中MCP-1蛋白的表達(dá)情況。并將篩選出的穩(wěn)定表達(dá)MCP-1的B16細(xì)胞及對照組細(xì)胞細(xì)胞用MTT法增殖實(shí)驗(yàn)，用酶標(biāo)檢測儀測定490nm波長出的OD值。 7.小鼠黑色素瘤B16MCP-1趨化型腫瘤細(xì)胞疫苗B16-MCP-1體外功能檢測 首先用多步驟離心法收集趨化型腫瘤細(xì)胞疫苗B16-MCP-1中趨化因子MCP-1，選取健康裸鼠，頸椎脫臼法處死裸鼠取其脾臟，密度梯度離心法收集裸鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞。用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)對趨化型腫瘤細(xì)胞疫苗B16-MCP-1對單個(gè)核細(xì)胞體外趨化活性的測定。倒置顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野下遷移至微孔膜背面的淋巴細(xì)胞數(shù)。按下式計(jì)算趨化指數(shù):趨化指數(shù)=實(shí)驗(yàn)組移行的細(xì)胞數(shù)/對照組移行的細(xì)胞數(shù)。 8. BABL/c型小鼠T細(xì)胞的分離 頸椎脫臼法處死小鼠，無菌條件下取出小鼠的胸腺，在滅菌載玻片上研磨在研磨的過程中滴加不含血清的培養(yǎng)基，后經(jīng)300目金屬網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞懸液，使用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，無菌PBS洗滌2次，將細(xì)胞接種于完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)2h后，吸出未貼壁的細(xì)胞用尼龍毛柱分離小鼠T淋巴細(xì)胞。 9.裸鼠部分免疫功能重建及預(yù)防性接種 將篩選出的適于實(shí)驗(yàn)的裸鼠45只隨機(jī)進(jìn)行分三組，每組15只：第一組為生理鹽水空白對照組（Nacl組），第二組為空載體pEGFP-N1轉(zhuǎn)染細(xì)胞對照組（野生型B16疫苗組），第三組為趨化型腫瘤疫苗B16-MCP-1治療組（趨化型B16-MCP-1疫苗組）。 裸鼠部分免疫系統(tǒng)功能重建：將分離出的小鼠胸腺T細(xì)胞經(jīng)腹腔注射的方法注射到篩選出的裸鼠體內(nèi)，3×107/只（0.5ml），以恢復(fù)裸鼠部分免疫系統(tǒng)的功能。 預(yù)防性接種：采用左側(cè)腹股溝皮下，單點(diǎn)注射對裸鼠進(jìn)行免疫接種，Nacl組注射0.2mL Nacl，空載體細(xì)胞組注射空載體pEGFP-N1轉(zhuǎn)染細(xì)胞0.2mL（含細(xì)胞2×104），B16-MCP-1細(xì)胞組注射趨化型腫瘤疫苗B16-MCP-10.2mL（含細(xì)胞2×104）。免疫接種每周一次，共3次。 10.裸鼠黑色素瘤動物模型的建立的觀察 第3次免疫接種后1周，在裸鼠右肩背單點(diǎn)注射野生型小鼠黑色素瘤細(xì)胞B160.2mL（也就是2×104/mL/只）建立裸鼠黑色素瘤模型。 觀察模型裸鼠的一般情況，成瘤后觀察移植瘤的生長情況，每隔2～3天記錄一次裸鼠的體重，游標(biāo)卡尺測腫瘤長徑及短徑（長徑a值短徑b值）記錄腫瘤大小，共觀察11周。按照下述公式計(jì)算小鼠腫瘤體積，腫瘤體積=長×寬2×0.52。裸鼠發(fā)生死亡終止進(jìn)行腫瘤體積大小的測量，進(jìn)行生存期的觀察。 11.腫瘤細(xì)胞疫苗B16-MCP-1對裸鼠脾淋巴細(xì)胞CTL殺傷活性的影響 以上各組實(shí)驗(yàn)小鼠每組取5只裸鼠，于第3次免疫接種后1周，用頸椎脫臼法處死裸鼠，解剖裸鼠腹腔取其脾臟，采用密度梯度離心法制備裸鼠脾臟淋巴細(xì)胞最為效應(yīng)細(xì)胞，小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16作為靶細(xì)胞，按照效應(yīng)細(xì)胞:靶細(xì)胞為25:1將各組裸鼠脾臟淋巴細(xì)胞及小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后棄去上清200L，加入MTT溶液15L/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清，以DMSO溶解MTT，用酶標(biāo)檢測儀于波長570nm測定OD值，計(jì)算殺傷率。淋巴細(xì)胞的殺傷率（%）=（1-（效應(yīng)細(xì)胞OD值+靶細(xì)胞OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/靶細(xì)胞OD值）×100%。 研究結(jié)果 1.小鼠MCP-1基因的RT-PCR結(jié)果 以小鼠肝臟組織提取的總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可以觀察到特異性擴(kuò)增帶，條帶大小相當(dāng)于480bp，與預(yù)期的大小完全一致。 2.重組質(zhì)粒pEGFP-N1-MCP-1的酶切鑒定結(jié)果 將回收的MCP-1的PCR產(chǎn)物與載體pEGFP-N1進(jìn)行連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，將挑選出的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒的提取，經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切后行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示在4.7kb處和480bp處各有一條亮帶，與質(zhì)粒載體及目的基因大小相符，證明所構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-MCP-1大小及方向正確�？召|(zhì)粒組只在4.7kb處有一條亮帶。 3.重組細(xì)胞的鑒定 小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染并經(jīng)G418篩選后，對抗性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)約3周左右收獲各組細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR并進(jìn)行行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)在大約480bp處出現(xiàn)一條明顯條帶，與陽性對照組條帶相對應(yīng)，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組無目的條帶的出現(xiàn)。ELISA結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組可見MCP-1的表達(dá)，而對照組未見有陽性結(jié)果出現(xiàn)。 4. Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)對趨化型腫瘤細(xì)胞疫苗B16-MCP-1對單個(gè)核細(xì)胞體外趨化活性的測定結(jié)果 趨化型腫瘤細(xì)胞疫苗B16-MCP-1組細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯高于空白培養(yǎng)基陰性對照組及野生型B16疫苗組，而野生型B16疫苗組趨化的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)目與陰性對照組相似，，表明趨化型疫苗B16-MCP-1能夠表達(dá)并分泌具有趨化功能的MCP-1趨化因子。 5.免疫接種后各組黑色素瘤小鼠模型的大體觀察 動物模型建立后第4d開始部分裸鼠有可觸及的腫瘤生成，30d后，第一組和第二組裸鼠全部有肉眼可見的腫瘤，30d成瘤率100%。第三組裸鼠至第30d開始成瘤，成瘤率為20%，至第50d成瘤率為60%。有4只裸鼠在觀察時(shí)間內(nèi)未見腫瘤形成。第30d開始第一組開始有2只裸鼠腫瘤發(fā)生破潰，實(shí)驗(yàn)全程該組總共有5只裸鼠發(fā)生腫瘤的潰破。第35d開始第二組有1只裸鼠腫瘤發(fā)生破潰，實(shí)驗(yàn)全程共2只裸鼠腫瘤發(fā)生破潰。第三組第60d有1只裸鼠腫瘤發(fā)生破潰，但潰破程度較輕，本組中其余荷瘤裸鼠在實(shí)驗(yàn)過程中未見腫瘤破潰。 第一組和第二組裸鼠出現(xiàn)明顯消瘦，裸鼠目光呆滯，活動減弱等惡液質(zhì)現(xiàn)象，第三組裸鼠生存狀態(tài)明顯好于前兩組裸鼠。 6.腫瘤生長情況觀察 動物模型建立2周內(nèi)各組裸鼠腫瘤體積大小無明顯差異（P0.05），2周以后至整個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，第三組裸鼠腫瘤體積明顯小于第一組（P㩳0.05），19d開始至整個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)內(nèi)三組裸鼠兩兩之間的體積比較均有明顯差異（P㩳0.05）。 7.小鼠生存時(shí)間觀察 動物模型建立后第7天開始第一組裸鼠開始出現(xiàn)死亡，第二組裸鼠10開始出現(xiàn)死亡，至第55d，第一組及第二組裸鼠全部出現(xiàn)死亡。第三組裸鼠至35d開始出現(xiàn)裸鼠死亡，至觀察結(jié)束（80d）仍有4只裸鼠存活。第三組與第一組及第二組相比，生存時(shí)間明顯延長（P0.01），第一組與第二組相比裸鼠生存時(shí)間基本一致（P0.05） 第三組與第一組及第二組相比，生存時(shí)間明顯延長（P0.01），第一組與第二組相比裸鼠生存時(shí)間基本一致（P0.05）。 8.腫瘤細(xì)胞疫苗B16-MCP-1對小鼠脾淋巴細(xì)胞CTL殺傷活性的影響 與第一組及第二組相比，第三組淋巴細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的活性，兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01），而第一組和第二組則無明顯特異性殺傷作用，兩者相比差異不大（P0.05）。這表明轉(zhuǎn)染MCP-1提高了裸鼠對惡性黑色素瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用，提高了裸鼠的抗腫瘤特性。 結(jié)論 1.成功構(gòu)建MCP-1真核表達(dá)載體pEGFP-N1-MCP-1。 2.成功構(gòu)建小鼠趨化型腫瘤疫苗B16-MCP-1，該疫苗在體外具有趨化小鼠單個(gè)核細(xì)胞的功能。 3.該趨化型疫苗對裸鼠惡性黑色素瘤具有明顯的免疫效果，能減輕荷瘤裸鼠的癥狀，延長裸鼠的生存期。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2053923