本文選題：角質形成細胞 + 炎癥因子��； 參考：《華中科技大學》2015年博士論文

【摘要】：第一部分：脂氧素A4通過調控SOCS2/TRAF6抑制脂多糖誘導的人角質形成細胞炎性因子的釋放 目的：研究脂氧素A4(LXA4)對脂多糖誘導的人角質形成細胞分泌細胞因子和趨化因子的作用效應及其可能上游機制。 方法：分離培養(yǎng)正常人表皮角質形成細胞,首先逆轉錄PCR檢測TLR4、脂氧素受體(ALXR)和芳香烴受體(AhR)在人角質形成細胞上的表達情況；實驗分為三組： 對照組.LPS(10ug/ml)組及LXA4(100nmol/L)+LPS組,分別作用相應的時間后,實時熒光定量PCR和ELISA分別從mRNA水平和蛋白水平檢測各組角質形成細胞不同時間點TNF-a和IL-1β的表達量;實時熒光定量PCR和蛋白質印跡試驗分別從mRNA水平和蛋白水平檢測各組角質形成細胞SOCS2和TRAF6的表達；蛋白質印跡試驗檢測各組細胞細胞核中核轉錄因子NF.kB的表達量。 結果：人角質形成細胞表達TLR4、脂氧素受體及芳香烴受體；從mRNA水平和蛋白水平,LXA4明顯抑制LPS刺激誘導的TNF-a、IL-1β及TRAF6在角質形成細胞中的高表達,上調LPS干預下SOCS2的低表達；LXA4抑制LPS誘導的角質形成細胞中NF-κB的核轉位。 結論：LXA4可能通過上調SOCS2降解TRAF6抑制脂多糖刺激誘導的角質形成細胞TNF-a和IL-1p的表達。 第二部分：脂氧素A4通過ERK/NF-kB信號通路抑制人角質形成細胞增殖及炎性因子/趨化因子的釋放 目的：研究在未激活及脂多糖刺激活化下的人角質形成細胞中,LXA4對細胞增殖和分泌炎性細胞因子及趨化因子的作用,探尋LXA4對角質形成細胞細胞周期和下游抗炎信號通路的機制研究。 方法：實驗分為四組,對照組、LXA4組(100noml/L)、LPS組(10ug/ml)和LXA4+LPS組。用WST-8和CFSE細胞示蹤法檢測細胞增殖及DNA染色流式細胞術檢測細胞周期；實時熒光定量PCR和ELISA分別從mRNA水平和蛋白水平檢測各組角質形成細胞細胞炎性因子和趨化因子的表達；實時熒光定量PCR和蛋白質印跡試驗分別從mRNA水平和蛋白水平檢測cyclin D1和p16INK4A的表達；蛋白質印跡試驗檢測ERK1/2和核轉錄因子NF-kB的表達量。 結果：對未激活及脂多糖刺激活化下的人角質形成細胞,LXA4抑制其細胞增殖及炎癥細胞因子/趨化因子的釋放；對角質形成細胞造成細胞周期G0/G1期阻滯；細胞周期蛋白cyclin D1的表達被LXA4抑制,同時促進p16INK4A分子的表達；ERK1/2的磷酸化和NF-kB-p65的核轉位都被LXA4所抑制。 結論：LXA4能抑制未激活及脂多糖刺激活化下人角質形成細胞增殖和細胞炎性因子的釋放,這種效應可能是通過干預信號分子cyclin D1/P16INK4A. ERK1/2和NF-kB實現的。 第三部分：脂氧素A4腹腔注射改善咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮損 目的：觀察LXA4對咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病模型的干預作用。 方法：30只雌性Balb/C小鼠,隨機等分為正常對照組、模型組及LXA4組。采應用銀屑病皮損面積和疾病嚴重程度評分標準(psoriasisarea and severity index, PASI)觀測各組模型小鼠皮損變化；光鏡下測量表皮層厚度；光鏡下觀察皮損組織形態(tài)學變化;采用流式細胞術檢測各組小鼠脾臟細胞CD4+T細胞中Th1及Th17細胞的分化差異。結果：模型組小鼠背部皮膚出現紅斑、鱗屑及皮損增厚;皮損組織病理表現為角化不全、中性粒細胞微膿腫及表皮棘層增厚；真皮大量炎癥細胞浸潤,脾臟Th17細胞比例上升。與模型組比較,LXA4組小鼠銀屑病樣皮損紅斑、鱗屑及增厚癥狀緩解,PASI分數降低,表皮厚度顯著降低,皮損中性粒細胞微膿瘍基本消退,角質形成細胞增殖明顯減輕,真皮淺層炎癥細胞浸潤減少,脾臟Th17細胞比例下調。 結論：LXA4能通過促中性粒細胞消退、抑制表皮細胞過度增殖及調節(jié)T淋巴細胞分化改善咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮損。
[Abstract]:Part I: lipoxygenin A4 inhibits lipopolysaccharide induced release of inflammatory cytokines in human keratinocytes by regulating SOCS2/TRAF6.
Objective: To study the effect of lipoxin A4 (LXA4) on lipopolysaccharide induced cytokine and chemokines in human keratinocytes and its possible upstream mechanism.
Methods: normal human epidermal keratinocytes were isolated and cultured. First, the expression of TLR4, lipoxygenin receptor (ALXR) and aromatic hydrocarbon receptor (AhR) in human keratinocytes were detected by reverse transcriptase PCR. The experiment was divided into three groups:
In the control group.LPS (10ug/ml) and the LXA4 (100nmol/L) +LPS group, the real-time fluorescence quantitative PCR and ELISA were used to detect the expression of TNF-a and IL-1 beta in different time points of keratinocytes from each group from mRNA level and protein level, respectively. Real time fluorescence quantitative PCR and protein blotting tests were examined from mRNA level and protein level respectively. The expression of SOCS2 and TRAF6 in keratinocytes was measured, and the expression of nuclear transcription factor NF.kB was detected by Western blot.
Results: human keratinocytes express TLR4, lipoxygenin receptor and aromatics receptor. From the level of mRNA and protein, LXA4 obviously inhibits the TNF-a induced by LPS, the high expression of IL-1 beta and TRAF6 in keratinocytes, up regulation of the low expression of SOCS2 under the intervention of LPS; LXA4 inhibits the nuclear transposition of NF- kappa of LPS induced keratinocytes.
Conclusion: LXA4 may inhibit the expression of TNF-a and IL-1p in keratinocytes stimulated by lipopolysaccharide by up regulating the degradation of TRAF6 by SOCS2.
The second part: lipoxygenin A4 inhibits keratinocyte proliferation and the release of inflammatory factors / chemokines through ERK/NF-kB signaling pathway.
Objective: To investigate the effect of LXA4 on the proliferation and secretion of inflammatory cytokines and chemokines in human keratinocytes under inactivation and lipopolysaccharide activation, and to explore the mechanism of LXA4 on the cell cycle of keratinocytes and the mechanism of the downstream anti-inflammatory signaling pathway.
Methods: the experiment was divided into four groups, the control group, the LXA4 group (100noml/L), the LPS group (10ug/ml) and the LXA4+LPS group. The cell proliferation was detected by WST-8 and CFSE cell tracer, and the cell cycle was detected by the flow cytometry with DNA staining. The real-time fluorescent quantitative PCR and ELISA were used to detect the inflammatory factors of the keratinocyte cells from the mRNA level and protein level, respectively. The expression of chemokine; real-time fluorescence quantitative PCR and protein blotting test were used to detect the expression of cyclin D1 and p16INK4A from mRNA level and protein level, and the expression of ERK1/2 and nuclear transcription factor NF-kB was detected by Western blot test.
Results: LXA4 inhibited the proliferation of cells and the release of inflammatory cytokines / chemokine in human keratinocytes which were unactivated and activated by lipopolysaccharide. The cell cycle blocked the cell cycle of keratinocytes; the expression of cyclin cyclin D1 was inhibited by LXA4, and the expression of p16INK4A molecules was promoted; ERK1/2 Phosphorylation and nuclear translocation of NF-kB-p65 were inhibited by LXA4.
Conclusion: LXA4 can inhibit the proliferation of human keratinocytes and the release of inflammatory cytokines from inactivation and lipopolysaccharide activation. This effect may be achieved by interfering with the signal molecule cyclin D1/P16INK4A. ERK1/2 and NF-kB.
The third part: lipoxygenin A4 intraperitoneal injection improves imiquimod induced psoriasis like lesions in mice.
Objective: To observe the effect of LXA4 on the murine model of psoriasis induced by imiquimod.
Methods: 30 female Balb/C mice were randomly divided into the normal control group, the model group and the LXA4 group. The skin lesions of psoriasis and the severity of disease severity score (psoriasisarea and severity index, PASI) were used to observe the changes of skin lesions in each model mice, the thickness of the cortex was measured under light microscope, and the morphological changes of skin lesions were observed under light microscope. The differentiation of Th1 and Th17 cells in the CD4+T cells of spleen cells of each group was detected by flow cytometry. Results: the skin of the model group had erythema, scaly and skin lesions, and the pathological features of the skin lesions were keratosis, neutrophils microabscess and the thickening of the epidermis, the infiltration of numerous inflammatory cells in the dermis, and the spleen Th The proportion of 17 cells increased. Compared with the model group, the erythema, scaly and thickening symptoms of psoriatic skin lesions in the LXA4 group were relieved, the PASI score was reduced, the thickness of the epidermis was significantly reduced, the neutrophils microabscess was basically subsided, the proliferation of keratinocytes was significantly reduced, the infiltration of the superficial dermal inflammatory cells decreased, and the proportion of Th17 cells in the spleen was down.
Conclusion: LXA4 can improve the psoriasis like skin lesions of mice induced by imiquimod by promoting neutrophil degeneration, inhibiting the overproliferation of epidermal cells and regulating the differentiation of T lymphocyte.
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R758.63

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本文編號：2006912