本文選題：惡性黑色素瘤 + 單鏈抗體　； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》2017年09期

【摘要】：目的構(gòu)建抗MM單鏈抗體-魚精蛋白融合蛋白表達載體,并驗證其表達效率及功能。方法通過PCR方法將魚精蛋白截短片段序列與抗黑色素瘤細(xì)胞表面抗原單鏈抗體基因相連接;采用TaKaRap MD19-T載體試劑盒將PCR后獲得的融合蛋白擴增產(chǎn)物進行T載體構(gòu)建;構(gòu)建GST融合蛋白表達載體以實現(xiàn)在大腸桿菌中該融合蛋白的可溶性表達,經(jīng)兩步親和純化后獲得scFv-tP蛋白;采用凝膠阻滯電泳遷移率變動分析EMSA技術(shù)檢測Anti-MM scFv-tP與siRNA的結(jié)合活性;熒光分子標(biāo)記scFv-tP蛋白后分別采用流式細(xì)胞術(shù)檢測和共聚焦顯微鏡觀察其與Li Br細(xì)胞株進行細(xì)胞表面抗原結(jié)合活性驗證;采用不同濃度FITC標(biāo)記的siRNA與scFv-tP進行混合,分別與LiBr細(xì)胞(A)及DU145細(xì)胞(B)進行混合孵育,觀察腫瘤細(xì)胞對攜載siRNA的單鏈抗體的內(nèi)化活性。結(jié)果成功構(gòu)建抗惡性黑素瘤單鏈抗體-魚精蛋白片段融合蛋白(Anti-MM scFv-tP)表達載體;實現(xiàn)在大腸桿菌中該融合蛋白的可溶性表達,可獲得較純的scFv-tP蛋白;Anti-MM scFv-tP蛋白與siRNA有明顯的結(jié)合與攜載能力,可以有效與LiBr細(xì)胞表面特異性抗原進行結(jié)合,且有較強的內(nèi)化活性。結(jié)論本研究構(gòu)建的抗MM單鏈抗體-魚精蛋白融合蛋白表達載體可穩(wěn)定表達,Anti-MM scFv-tP蛋白具有siRNA結(jié)合攜載能力,可靶向識別結(jié)合進入LiBr細(xì)胞,為后續(xù)進一步研究該單鏈抗體融合蛋白靶向載體攜載siRNA在體內(nèi)外抑制惡性黑色素瘤惡性進展奠定堅實的基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to construct the expression vector of anti-MM single-chain antibody-protamine fusion protein and to verify its expression efficiency and function. Methods the truncated fragment of protamine was linked to the single chain antibody gene against melanoma cell surface antigen by PCR, and the fusion protein amplification product was constructed by Taka Rap MD19-T vector kit. The expression vector of GST fusion protein was constructed to realize the soluble expression of the fusion protein in Escherichia coli, and the scFv-tP protein was obtained after two-step affinity purification, and the binding activity of Anti-MM scFv-tP to siRNA was detected by EMSA. Fluorescent molecular markers of scFv-tP protein were detected by flow cytometry and confocal microscopy, respectively, and the cell surface antigen binding activity of scFv-tP was detected by confocal microscopy, and then mixed with scFv-tP with different concentrations of FITC-labeled siRNA. The tumor cells were incubated with libr cells (A) and DU145 cells (B), respectively, to observe the internalization activity of tumor cells against siRNA carrying scFv. Results the fusion protein Anti-MM scFv-tP was successfully constructed and the soluble expression of the fusion protein was realized in Escherichia coli. The purified scFv-tP protein anti-MM scFv-tP protein has obvious binding and carrying ability with siRNA. It can effectively bind to libr cell surface specific antigen and has strong internalization activity. Conclusion the expression vector of anti-MM single-chain antibody and protamine fusion protein constructed in this study can stably express Anti-MM scFv-tP protein with siRNA binding ability and can be targeted recognition binding into libr cells. The results provide a solid foundation for further study on the inhibition of malignant melanoma by siRNA carried by the fusion protein vector in vivo and in vitro.
【作者單位】： 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科;河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院預(yù)防保健科;浙江加州國際納米技術(shù)研究院;西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科;西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系;中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心;中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(30960349)~~
【分類號】：R739.5

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本文編號：1999095