本文選題：真皮細(xì)胞 + 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶　； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：背景： 現(xiàn)代毛發(fā)修復(fù)外科技術(shù),雖然其療效肯定、持久,得到廣大禿發(fā)患者的認(rèn)可,但實踐證明無論是哪一種修復(fù)技術(shù)的采用,都是以患者自體擁有充足的供區(qū)毛發(fā)為前提。對于禿區(qū)面積過大,甚至毛發(fā)完全缺失的患者,這些修復(fù)技術(shù)常無法開展。即便開展,也由于供區(qū)不足、移植成活率不穩(wěn)定等因素,手術(shù)后的毛發(fā)密度也無法達(dá)到滿意效果。況且任何外科手術(shù)都不會產(chǎn)生新的頭發(fā),不會增加頭發(fā)的數(shù)量。許多禿發(fā)患者頭發(fā)的丟失是進(jìn)行性的,毛發(fā)修復(fù)也不能逆轉(zhuǎn)或使其停止,也無法預(yù)測其發(fā)展情況。所以,供區(qū)毛發(fā)資源明顯不足,成為現(xiàn)今毛發(fā)修復(fù)外科較難解決的問題。 毛發(fā)發(fā)生過程是胚胎上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞相互作用所致。在毛發(fā)發(fā)育早期,間充質(zhì)細(xì)胞聚集于上皮細(xì)胞下,隨后形成真皮聚集物,最后形成真皮乳頭并促使毛囊發(fā)育成熟。在此基礎(chǔ)上發(fā)展出的毛囊細(xì)胞移植技術(shù)(follicular cell implantation、FCI),是將具有毛囊誘導(dǎo)能力的細(xì)胞,如成體真皮乳頭細(xì)胞(dermal papilla cells、DPCs)、真皮鞘細(xì)胞、胚胎或新生真皮細(xì)胞等目標(biāo)細(xì)胞,進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增,而后將其植入禿發(fā)區(qū),重新模擬毛囊發(fā)育過程,并最終誘導(dǎo)出許多新生毛囊來。許多研究者發(fā)現(xiàn)從成年生長期毛囊分離出的真皮乳頭放于表皮附近可誘導(dǎo)形成新的毛囊。另有學(xué)者從新生鼠皮膚分離真皮細(xì)胞注射至成年裸鼠軀干皮下,8-12天可形成新的毛囊,并具有毛發(fā)周期性。這些實驗都為FCI技術(shù)提供了實驗基礎(chǔ)。而目前該技術(shù)主要障礙在于,毛囊細(xì)胞誘導(dǎo)能力流失之前僅能做到幾次倍增。如不能獲得大量細(xì)胞的同時保持誘導(dǎo)能力,細(xì)胞移植方法就無法在同毛發(fā)移植手術(shù)的比較中取得優(yōu)勢。 具有毛囊誘導(dǎo)功能的永生化細(xì)胞株構(gòu)建為FCI技術(shù)突破技術(shù)瓶頸提供了一個新的方向。目前研究證實細(xì)胞衰老與細(xì)胞內(nèi)染色體端粒程序性縮短有關(guān)。當(dāng)端粒縮短至一定限制長度時,細(xì)胞脫離細(xì)胞周期而停止生長。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶,由RNA及相關(guān)蛋白組成,它以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒重復(fù)序列以維持端粒長度。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)是端粒酶的催化亞單位,它的表達(dá)與端粒酶活性有強(qiáng)烈的相關(guān)性,是端粒酶激活的決定因素。將TERT基因?qū)牒?細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)端粒酶,并在一個相當(dāng)長時間的保持染色體組正常同時以正常方式持續(xù)生長。如果能建立成熟的永生化毛囊細(xì)胞株技術(shù),也可為獲得大量穩(wěn)定的具有誘導(dǎo)能力的種子細(xì)胞提供一個新的方法。 在本實驗中我們構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-N1-TERT,嘗試將TERT基因?qū)胄律笳嫫ぜ?xì)胞來保持細(xì)胞毛囊誘導(dǎo)能力,延長細(xì)胞的壽命,為毛囊細(xì)胞移植提供良好的種子細(xì)胞來源。同時將獲得的TERT高表達(dá)的新生鼠真皮細(xì)胞,培養(yǎng)后植入裸鼠皮下,初步探討FCI。 目的： 1.建立新生C57小鼠真皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定方法 1.1建立獲得含毛囊誘導(dǎo)能力的C57小鼠真皮細(xì)胞方法,提供種子細(xì)胞的真皮成分； 1.2培養(yǎng)真皮細(xì)胞,觀察細(xì)胞形態(tài)及生長周期； 1.3確認(rèn)真皮細(xì)胞表達(dá)的代表毛囊誘導(dǎo)能力的各項指標(biāo)。 2.建立永生化真皮細(xì)胞的方法 2.1確定TERT引物設(shè)計,合成,構(gòu)建載體方法； 2.2病毒包裝,細(xì)胞轉(zhuǎn)染,穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選； 2.3獲得穩(wěn)定細(xì)胞株培養(yǎng)觀察,檢測毛囊誘導(dǎo)能力。 3.建立細(xì)胞移植動物體內(nèi)誘導(dǎo)毛囊模型 3.1確認(rèn)細(xì)胞移植方法； 3.2細(xì)胞示蹤,確認(rèn)移植細(xì)胞參與形成的毛囊成分。 方法： 1.基因選取及引物序列設(shè)計：根據(jù)pLEGFP-N1表達(dá)載體圖譜,從NCBI選定TERT基因序列(NM：009354)進(jìn)行分析,設(shè)計如下引物：TERT-F:5'CCCAAGCTTATGACCCGCGCTCCTCGTTG3'; TERT-R:5'ACGCGTCGACCGGTCCAAAATGGTCTGAAAGTCTGT3'。 2.載體構(gòu)建及檢測：從新鮮小鼠肝臟組織提取RNA,反轉(zhuǎn)錄為CDNA后行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后,反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物。采用DNA回收試劑盒從PCR產(chǎn)物中回收約3369bp目的片段。把TERT膠回收產(chǎn)物和pLEGFP-N1載體分別用HindⅢ和Sal I進(jìn)行酶切后,用T4DNA連接酶進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,經(jīng)過菌落PCR,酶切鑒定后送去英駿公司測序。挑取菌落PCR鑒定出來的單克隆進(jìn)行培養(yǎng),用普通質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,用BamHI進(jìn)行單酶切鑒定。 3.質(zhì)粒小提：采用堿裂解大腸桿菌,再通過離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異地結(jié)合溶液中的DNA。離心吸附柱使用硅基質(zhì)材料,高效、專一吸附DNA。同時將空載質(zhì)粒pLEGFP-N1轉(zhuǎn)化后小提。 4.細(xì)胞培養(yǎng)：取出生第一天的C57鼠背部皮膚,剪為約0.5cm×0.5cm大小組織塊,用0.1%中性蛋白酶4℃消化過夜。顯微鑷將表皮和真皮分離。將真皮剪碎,0.2%膠原酶37℃孵育30min左右,200目篩網(wǎng)過濾,收集細(xì)胞加入DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng),第3代細(xì)胞作為實驗研究,將細(xì)胞分為2組：pLEGFP-N1組(對照組)和pLEGFP-N1-TERT組。 5. QPCR檢測：設(shè)空白對照,將兩組細(xì)胞同時分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染5h,更換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基,置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),轉(zhuǎn)染24、36、48h后QPCR檢測。 6.氯化銫大提：將構(gòu)建好的過表達(dá)載體pLEGFP-N1-TERT與空載pLEGFP-N1分別轉(zhuǎn)化到STBL3感受態(tài)細(xì)胞中,加入Buffer II,上下顛倒混勻,冰上靜置10min,充分裂解細(xì)菌；11gCscl及1mlEB(儲備液濃度10mg/ml),待其充分溶解混勻后離心；DNA液中加入等體積的水飽和正丁醇(4ml左右)劇烈搖晃均勻,反復(fù)多次萃��；加入1ml的TE,在加入2.5倍體積的無水乙醇,室溫靜置,使乙醇充分溶解DNA上的Cscl提純。 7.病毒包裝：制備質(zhì)�；旌衔镉�1.5ml EP中：ddH2O110μl,1M CaCl250μlPIK(包裝質(zhì)粒)20μg,2XHBS200μl, pLEGFP-Nl-TERT質(zhì)粒20μg�；靹蚝笫覝胤胖�15-20min。將質(zhì)�；旌衔锞鶆蚣尤氪D(zhuǎn)染293FT細(xì)胞皿中,輕輕搖動使混勻。37℃孵箱5-6h。棄掉培養(yǎng)基,PBS洗3次。換新鮮培養(yǎng)基,37℃孵育繼續(xù)培養(yǎng)至48h。收集轉(zhuǎn)染后72h的293FT細(xì)胞上清作為病毒液體,以0.45μm的濾器過濾,分裝1.2ml/cryotube-80℃保存。pLEGFP-N1包裝病毒方法相同。 8.細(xì)胞感染與病毒滴度檢測：用10ml無菌注射器吸取上清,后每3h收集一次,共3-4次。每次吸取上清以0.45μm的濾器過濾后感染細(xì)胞,感染時加入polybrene (2ug/ml)。病毒感染細(xì)胞后,G418篩選7天,得到穩(wěn)定細(xì)胞株,擴(kuò)增培養(yǎng)。測定病毒滴度。病毒滴度(PFU/ml)=GFP陽性細(xì)胞數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)/0.01ml。 9.細(xì)胞生長曲線繪制：將typran染色95%的細(xì)胞以104/孔密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔體積200μl,各時間點(diǎn)均設(shè)3復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后加入5mg/ml MTT20μl/孔,37℃,5%CO2繼續(xù)孵育4h,小心吸棄上清,加入DMSO150μl/孔,充分混勻,于Bio-Tek酶標(biāo)儀分析492nm處OD值,繪制兩組細(xì)胞生長曲線并比較。 10.Western Blot檢測：檢測兩組細(xì)胞TERT、BMP-4的表達(dá)情況。提取總蛋白,測定濃度后各取50μg蛋白,SDS-PAGE凝膠60V電泳1.5h后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂奶37℃封閉1h,使用1：3000的稀釋度稀釋抗體,然后4℃孵育過夜；使用Goat anti-Mouse二抗1：6000孵育相應(yīng)的膜,搖床緩慢搖動,室溫120min;ECL試劑盒化學(xué)發(fā)光后曝光成像,同時檢測β-actin(一抗1：500稀釋)的表達(dá)作為內(nèi)參。 11.流式細(xì)胞儀檢測：將typran染色95%的細(xì)胞以106/孔種于12孔板。0.25%胰蛋白酶收集細(xì)胞。重懸細(xì)胞于含有1：50稀釋的FITC-CD34和FITC-CD44抗體或1：20稀釋的FITC-CD133抗體(以1：50稀釋的mouse IgG/FITC作為對照),37℃,30min。流式細(xì)胞儀激發(fā)波長Ex=488nm；發(fā)射波長Em=530nm,檢測陽性率。 12.免疫組化：細(xì)胞于1×105接種于無菌蓋玻片上,待細(xì)胞60%融合時,經(jīng)PBS漂洗3次(每次5min),預(yù)冷丙酮固定10min,然后常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)方法染色,檢測versicar、TERT的表達(dá)情況,以PBS代替一抗作陰性對照。 13.流式細(xì)胞周期：收集處理后的細(xì)胞,重懸后逐滴加入無水乙醇中4℃避光固定過夜,重懸細(xì)胞于500μl含100unit/ml的RNase A的PBS緩沖液中,避光37℃孵育30min。加2mg/ml PI至終濃度50μg/ml,避光37℃孵育30min。流式細(xì)胞儀激發(fā)波長488nm,發(fā)射波長525nm檢測。 14.移植表皮制備：受體裸鼠腹部皮膚,剪為約0.5cm×0.5cm大小組織塊,用0.1%中性蛋白酶4℃消化過夜。PBS(含1%青、鏈霉素)漂洗3次,顯微鑷將表皮和真皮分離。將表皮剪碎,0.2%膠原酶37℃孵育30min左右直到所有組織被消化。 15.細(xì)胞植入誘導(dǎo)：受體裸鼠麻醉成功后,常規(guī)消毒背部皮膚。將TERT穩(wěn)定株細(xì)胞與對照組細(xì)胞分別與獲得的表皮細(xì)胞重懸后,按1：1比例混合,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/μL,以200μL為一單位,無菌條件下以將兩組細(xì)胞懸液隨機(jī)在裸鼠背部中線兩側(cè)作皮下注射。每三天觀察體表毛發(fā)生長情況。21天后取材,按常規(guī)方法進(jìn)行組織切片,熒光顯微鏡下觀察誘導(dǎo)情況。 結(jié)果： 1. TERT基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,獲得3369bp大小的PCR片段,與目的基因大小相符。 2.挑取菌落PCR鑒定出來的單克隆,搖菌,提取質(zhì)粒后,用BamHI進(jìn)行單酶切鑒定,獲得約1800bp反應(yīng)物,大小與理論一致,進(jìn)一步表明TERT已經(jīng)插入pLEGFP-N1載體中,送公司測序,測序結(jié)果正確。 3. QPCR顯示實驗組TERT表達(dá)逐漸降低,并隨著時間推移穩(wěn)定存在。 4.根據(jù)GFP數(shù)法進(jìn)行滴度測定,測得逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度為1.0X109PFU/ml。轉(zhuǎn)染后獲得穩(wěn)定細(xì)胞株接種后24h內(nèi)貼壁,初為小圓形,細(xì)胞大小不均勻,核/漿比例較大。后逐漸伸展為短梭形及多角形和長梭形,熒光顯微鏡下可發(fā)綠色熒光。4d后形態(tài)呈成纖維細(xì)胞樣,核橢圓形,較大,部分區(qū)域呈聚集性生長。原代培養(yǎng)的細(xì)胞9d即達(dá)70%-80%融合。 5.細(xì)胞生長曲線顯示：實驗組細(xì)胞較對照組生長速度第二天后開始逐漸趨緩。 6.流式細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示TERT高表達(dá)細(xì)胞進(jìn)入G2/M期比例升高。 7. Western Blot結(jié)果顯示TERT高表達(dá)細(xì)胞株較對照組的TERT蛋白、BMP-4表達(dá)升高；流式細(xì)胞技術(shù)顯示其CD44、CD133表達(dá)升高。組織化學(xué)染色顯示其Versican、TERT表達(dá)升高。 8.FCI后裸鼠體表觀察：第2天觀察裸鼠體表注射位置,傷口已合攏,注射時產(chǎn)生表皮隆起已吸收。后每3天觀察裸鼠體表注射位置,移植部位3周后呈現(xiàn)輕微的隆起,可見色素沉著,翻開移植部位皮片,體視顯微鏡下可見皮下有大量毛發(fā)纖維生成。對照組有可見白色沉淀生成,未見明顯色素沉著,移植3周后翻開移植部位,可見少量或無毛發(fā)纖維生成。 9.組織取材切片后鏡下觀察TERT高表達(dá)細(xì)胞注射移植3周后,取移植部位組織切片染色。光鏡下可見大量呈毛囊結(jié)構(gòu),其中心為嗜伊紅染色的角化物質(zhì),向外依次為：內(nèi)根鞘、外根鞘、真皮鞘。熒光顯微鏡觀察顯示發(fā)綠色光,證實其為注射細(xì)胞誘導(dǎo)出。對照組白色沉淀切片后可見類脂肪沉積物質(zhì)。 結(jié)論： 本實驗成功構(gòu)建了逆轉(zhuǎn)錄病毒載pLEGFP-N1-TERT。該載體經(jīng)檢測結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,將該載體轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,包裝產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒,滴度高達(dá)1.0X109PFU/ml,且產(chǎn)生的病毒活性較高,感染效率高。感染新生鼠真皮細(xì)胞可在熒光顯微鏡下表達(dá)綠色熒光。Western Blot結(jié)果顯示實驗組細(xì)胞TERT蛋白、BMP-4蛋白表達(dá)明顯高于對照組細(xì)胞,顯示基因?qū)氤晒�。�?jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44、CD133的表達(dá)明顯增高提示實驗組細(xì)胞的毛囊誘導(dǎo)能力提高。免疫組織細(xì)胞化學(xué)染色顯示實驗組Versican表達(dá)升高,提示其細(xì)胞粘附能力和凝聚性生長能力提高,這也更有利于真皮乳頭的形成。將TERT高表達(dá)新生鼠真皮細(xì)胞移植于裸鼠皮下進(jìn)行毛囊誘導(dǎo),可見皮下有大量毛發(fā)纖維生成,組織切片檢查證實其由移植細(xì)胞構(gòu)成。該實驗證實在合適條件下移植細(xì)胞可誘導(dǎo)毛囊生成,說明毛囊在適當(dāng)?shù)臈l件下可以重建,證實了FCI的理論基礎(chǔ),為臨床上治療提供了新方向。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R758.71

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1964405