本文選題：淋病奈瑟菌 + 肽聚糖　； 參考：《吉林大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 淋病是由淋球菌引起的泌尿生殖系統(tǒng)的化膿性感染,嚴(yán)重危害著人類的健康。臨床上主要采用抗生素治療,近年來因抗生素的濫用和亂用,耐藥菌株大量出現(xiàn),急需調(diào)整抗生素用藥策略和研發(fā)新型的抗淋球菌藥物和藥物作用靶點(diǎn)。溶解性轉(zhuǎn)糖酶C(LtgC)通過催化切割肽聚糖β-1,4糖苷鍵斷裂,在淋球菌分裂和生長中發(fā)揮重要作用,可能是潛在的藥物作用靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用分子克隆和同源重組技術(shù)研究溶解性轉(zhuǎn)糖酶C的活性位點(diǎn)和特異的結(jié)構(gòu)域三對淋球菌生長分裂的影響,闡述作用機(jī)制,為研發(fā)新型抗淋球菌藥物提供一定的理論和實(shí)踐依據(jù)。 采用分子生物學(xué)方法獲得淋球菌FA19ltgC敲除株(FA19△ltgC)、D393A突變株(FA19ltgC_(D393A))、D405A突變株(FA19ltgC_(D405A))和結(jié)構(gòu)域三缺失株(FA19ltgC_(△DM3))和結(jié)構(gòu)域三表面七個氨基酸突變株(FA19ltgC_(7M))。野生型淋球菌FA19菌落表面光滑且明亮、無褶皺、邊緣完整;但FA19△ltgC的菌落表面出現(xiàn)褶皺和凸凹不平,菌體生長緩慢,四小時停止生長;且FA19ltgC基因的遺傳修復(fù)株(FA19 ltgC-com)可回復(fù)為FA19的表型,上述結(jié)果表明LtgC是淋球菌內(nèi)重要的、保守的功能性蛋白,該蛋白的缺失導(dǎo)致淋球菌細(xì)胞分裂不完全,生長緩慢。FA19ltgC_(D393A)和FA19ltgC_(D405A)菌落表型和FA19△ltgC菌落表型一致。FA19ltgC_(D393A)、FA19ltgC_(D405A)和FA19△ltgC細(xì)胞生長速度相近,均比FA19野生株生長緩慢,該結(jié)果暗示393位和405位的天冬氨酸共同作用切割肽聚糖糖苷鍵斷裂。 本實(shí)驗(yàn)采用分子克隆技術(shù)敲除LtgC結(jié)構(gòu)域三163-244位氨基酸,以及用氨基酸RGR替換LtgC的167-244位氨基酸,重組表達(dá)純化獲得兩個LtgC結(jié)構(gòu)域三突變體蛋白(LtgC_(△163-244)和LtgC_(△167RGR244)). LtgC_(△163-244)突變體蛋白在大腸桿菌體內(nèi)沒有表達(dá),但LtgC_(△167RGR244)蛋白表達(dá)量高且可溶性良好。將LtgC_(△167RGR244)基因同源重組到淋球菌基因組,獲得LtgC結(jié)構(gòu)域三缺失株(FA19ltgC_(△DM3)). FA19ltgC_(△DM3)的表型和FA19△ltgC表型相似,生長速度緩慢。但FA19ltgC_(7M)的表型和野生型未見顯著性差異。該結(jié)果表明,結(jié)構(gòu)域三是LtgC幫助淋球菌生長的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)區(qū)域,但不是其他蛋白結(jié)合位點(diǎn)。 大腸桿菌溶解性轉(zhuǎn)糖酶A( MltA)和淋球菌LtgC是同源蛋白,在結(jié)構(gòu)和功能方面有很多相似性.分別用mltA和ltgC基因?qū)tgC缺失株進(jìn)行遺傳修復(fù),發(fā)現(xiàn)ltgC和MltA的互補(bǔ)株完全回復(fù)淋球菌野生株的表型,而且MltA對淋球菌生長的促進(jìn)作用比LtgC更強(qiáng).在檢測MltA對淋球菌肽聚糖的切割作用時,觀察到MltA酶切活性受到淋球菌高度乙�；碾木厶堑囊种�,但可溶表達(dá)的LtgC蛋白切割未見酶切肽聚糖活性。 在LtgC的N端加入19個氨基酸的脂蛋白后, LtgC蛋白在E.coli Bl21中表達(dá)量很低,可能該脂蛋白對E.coli產(chǎn)生毒性作用使表達(dá)受到抑制,暗示LtgC蛋白需要脂蛋白序列協(xié)助發(fā)揮作用;攜帶脂蛋白序列的LtgC_(D393A)和LtgC_(D405A)突變株蛋白在大腸桿菌中表達(dá)量和LtgC可溶蛋白表達(dá)量相近,說明Asp393和Asp405位點(diǎn)突變抑制LtgC對大腸桿菌的毒性作用;但結(jié)構(gòu)域三表面的七重氨基酸突變體蛋白表達(dá)量仍然很低,證明結(jié)構(gòu)域三可能不是其他協(xié)同作用蛋白和LtgC的結(jié)合部位。 綜上所述,本研究證實(shí)LtgC是淋球菌生長和分裂的重要功能性酶,首次證明Asp393和Asp405是LtgC影響淋球菌生長的重要功能部位;結(jié)構(gòu)域三的缺失抑制淋球菌細(xì)胞分裂,但它不是多酶復(fù)合體的結(jié)合位點(diǎn);首次發(fā)現(xiàn)MltA可修復(fù)由LtgC缺失引起的淋球菌表型變化,并促進(jìn)淋球菌生長;無脂蛋白序列的LtgC無酶切活性,表明脂蛋白序列是LtgC的重要結(jié)構(gòu)。首次鑒定MltA體外活性受到淋球菌肽聚糖乙酰化抑制,可能與淋球菌避免自溶有關(guān)。本論文初步證明LtgC可能是潛在的淋球菌藥物作用靶點(diǎn),尤其是LtgC的Asp393和Asp405可視為篩選抑制劑的潛在靶標(biāo),為研發(fā)新型抗淋球菌藥物提供一定的理論依據(jù)。
[Abstract]:Gonorrhea is a purulent infection of the genitourinary system caused by Neisseria gonorrhoeae, which seriously endangers human health. The main clinical use of antibiotics is the use of antibiotics. In recent years, the drug abuse and disorderly use of antibiotics, a large number of drug-resistant strains appear, the urgent need to adjust the strategy of antibiotics and the research and development of new type of drug and drug target. Sexual trans glucoenzyme C (LtgC) breaks through the catalytic cutting of peptidoglycan beta -1,4 glycoside bonds and plays an important role in the division and growth of gonococci. It may be a potential target for drug action. The effect of molecular cloning and homologous recombination on the active site of soluble trans glucoenzyme C and the specific domain three on the growth and division of gonococci To explain the mechanism of action and provide theoretical and practical basis for the development of new anti gonococcal drugs.
FA19ltgC knockout strain (FA19 Delta ltgC), D393A mutant (FA19ltgC_ (D393A)), D405A mutant (FA19ltgC_ (D405A)), three deletion strains (FA19ltgC_ (DM3)) and seven amino acid mutant strains (FA19ltgC_) on the three surface of the domain of the domain were obtained by molecular biological methods. Wrinkle and complete edge; but the colony surface of FA19 Delta ltgC appears wrinkle and convex concave, the growth of the bacteria is slow, and the growth is stopped for four hours. And the genetic repair strain of FA19ltgC gene (FA19 ltgC-com) can revert to the phenotype of FA19. The above results indicate that LtgC is an important and conservative functional protein in gonococcus, and the loss of the protein leads to gonococcus fineness .FA19ltgC_ (D393A) and FA19ltgC_ (D405A) colony phenotype and FA19 Delta ltgC colony phenotype are consistent with.FA19ltgC_ (D393A). FA19ltgC_ (D405A) and FA19 Delta ltgC cells are similar in growth speed, and are slower than those of wild plants. The results suggest that 393 and 405 aspartic acids combine to cut peptidoglycan bonds. Crack.
In this experiment, the molecular cloning technique was used to knock out three 163-244 amino acids in the LtgC domain, and the amino acid RGR was used to replace 167-244 amino acids of LtgC. The recombinant expression was purified to obtain two LtgC domain three mutant proteins (LtgC_ (delta 163-244) and LtgC_ (delta 167RGR244)). The mutant protein of LtgC_ (delta 163-244) was not expressed in Escherichia coli. However, the expression of LtgC_ (delta 167RGR244) protein was high and soluble. The homologous LtgC_ (delta 167RGR244) gene was reorganized into the genome of gonococcus, and the phenotype of LtgC (delta DM3) was obtained. The phenotype of FA19ltgC_ (delta DM3) was similar to FA19 Delta ltgC, and the growth rate was slow. However, the phenotype and the wild type of the FA19ltgC_ (LtgC_) were not significant. The results indicate that domain three is a key structural area for LtgC to help Neisseria gonorrhoeae growth, but not other protein binding sites.
Escherichia coli lysis A (MltA) and gonococcal LtgC are homologous proteins. There are many similarities in structure and function. MltA and ltgC genes are used to repair ltgC missing strains, respectively. It is found that the complementary strains of ltgC and MltA fully respond to the phenotype of gonococcal wild strains, and MltA has a stronger effect on gonococcal growth than LtgC. When detecting MltA's cutting effect on gonococcal peptidoglycan, it was observed that the activity of MltA enzyme cutting was inhibited by the highly acetylated peptidoglycan, but the soluble expression of LtgC protein had no enzyme cut peptidoglycan activity.
After adding 19 amino acid lipoproteins at the N end of LtgC, the expression of LtgC protein in E.coli Bl21 is very low. It is possible that the lipoprotein has a toxic effect on E.coli, which inhibits the expression, suggesting that the LtgC protein needs the lipoprotein sequence to help to play a role; the LtgC_ (D393A) and LtgC_ (D405A) mutant protein carrying the lipoprotein sequence in the Escherichia coli The expression amount was similar to that of LtgC soluble protein, indicating that the mutation of Asp393 and Asp405 loci inhibited the toxic effect of LtgC on Escherichia coli, but the expression of the seven heavy amino acid mutant protein on the three surface of the domain was still very low, which proved that the domain three might not be the binding site of other synergistic egg white and LtgC.
To sum up, this study confirmed that LtgC is an important functional enzyme for the growth and division of gonococcus. It is the first time that Asp393 and Asp405 are important functional parts of LtgC that affect the growth of gonococcus; the deletion of the domain three inhibits the cell division of Neisseria gonorrhoeae, but it is not a binding site of the multi enzyme complex; it is the first time that MltA can be repaired by LtgC deletion. The phenotypic change of gonococcus and the growth of gonococcus, the LtgC without lipoprotein sequence showed that the lipoprotein sequence was an important structure of LtgC. It was first identified that the activity of MltA in vitro was inhibited by Neisseria gonorrhoeae acetylation, which may be related to the avoidance of Neisseria gonorrhoeae autolysis. This paper preliminarily proved that LtgC may be a potential drug for gonococcal drugs. Targeting targets, especially Asp393 and Asp405 of LtgC, can be regarded as potential targets for screening inhibitors, providing a theoretical basis for the development of new anti gonococcal drugs.

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R759.2

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本文編號：1851256