本文選題：白癜風 + 應激��； 參考：《復旦大學》2012年博士論文

【摘要】：白癜風是常見的色素脫失性皮膚病,通常認為自身免疫損傷是其最重要的發(fā)病機制,最新的研究觀察到T細胞亞群有增殖分化異常及平衡失調,尤其是具有免疫抑制功能的T細胞亞群——T調節(jié)細胞(Treg)水平降低與白癜風的發(fā)病密切相關。因此糖皮質激素、他克莫司等免疫抑制劑和調節(jié)劑就成為目前臨床治療白癜風的主要藥物。精神神經損傷也是白癜風的致病因素,但該領域的研究始終是個薄弱環(huán)節(jié),針對降低精神神經損傷而進行的藥物研發(fā)也處于空白狀態(tài)。 眾所周知,各種發(fā)病誘因對機體來說就是各種不同的應激原,精神神經刺激也是一種應激原。應激是機體對內外環(huán)境中各種不同的應激原作出的非特異性防御適應反應,機體出現包括精神、神經、內分泌和免疫系統(tǒng)等一系列綜合應答。應激負荷過強或過于持久,也可導致機體生理機能紊亂引發(fā)疾病,有學者甚至認為75%～90%的人類疾病與應激機制激活有關。本研究即從精神神經應激與白癜風發(fā)病關系入手,以白癜風患者發(fā)病前應激事件發(fā)生狀況與患病后應激障礙伴發(fā)狀況——應激相關的神經內分泌異�！{節(jié)精神神經應激障礙的藥物對黑素細胞增殖與功能的影響為軸線,以白癜風患者體內存在的精神神經內分泌功能失調及物質異常為線索,有針對性的進行藥物篩選以及藥物作用機制的研究,為白癜風治療藥物的研發(fā)提供新的思路和方向。 在應激反應過程中,機體的神經內分泌系統(tǒng)是最重要的應激反應系統(tǒng),主要以下丘腦—垂體—腎上腺皮質(hypothalamus-pituitary-adrenocortical, HPA)軸相關激素如促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin-releasing-hormone, CRH)、促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone, ACTH)、皮質激素水平產生變化為特征,因此對HPA軸功能狀況的觀察是用來評價應激程度的最經典方法。應激反應時還誘導產生其它多種應激相關激素和肽類物質,如β—內啡肽(β-endophin,β-EP)、血管活性腸肽、神經肽Y (neuropeptide-Y, NPY)等,其中NPY就是交感神經系統(tǒng)代表性物質,在心理及軀體應激反應的核心機制中發(fā)揮重要作用,被稱為“應激分子”,它對HPA軸的活動具有肯定的調節(jié)作用。此外應激損傷后機體會啟動內源性損傷保護因子進行調節(jié),其中褪黑素(melatonin, MLT)和神經生長因子(nerve growth factor, NGF)在神經營養(yǎng)、應激后神經損傷修復及神經功能恢復中的作用現已得到公認。NGF是最早發(fā)現的細胞生長調節(jié)因子,作為一種嗜神經多肽,NGF不僅作用于神經系統(tǒng),在非神經系統(tǒng)中也產生重要影響,越來越多的研究發(fā)現,NGF在許多皮膚病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。NGF的來源十分廣泛,不同來源的NGF具有相似的生物學活性,NGF是典型的靶源性神經營養(yǎng)因子,由靶組織產生和分泌,其中腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)就是中樞神經來源的NGF家族中一個重要成員,也是目前研究最多,對其功能了解最為清楚的。調控BDNF表達的因素很多,應激是其中一個重要因素,在不同的應激條件下,BDNF水平發(fā)生不同的變化,細胞機制研究提示BDNF水平下降是與應激障礙密切相關的病理生理現象,在應激相關性抑郁癥時血清BDNF水平降低。MLT是由松果體合成分泌的激素,生物學作用廣泛,具有較顯著的神經保護作用,研究發(fā)現MLT能通過有效促進前腦皮質細胞表達BDNF及其受體,激活細胞內保護性信號通路,減輕應激造成的細胞損傷。MLT血清濃度具有明顯的晝夜節(jié)律性波動,與HPA軸激素的晝夜節(jié)律正好相反,許多研究也證實HPA軸是MLT發(fā)揮調節(jié)作用所經由的一個重要途徑,實驗證明HPA軸的三個水平均存在MLT受體,MLT通過MLT受體對HPA軸的三個水平進行直接調節(jié)。研究發(fā)現長期慢性的生活應激事件可引起松果體功能失調導致MLT分泌紊亂,在某些精神分裂癥和抑郁癥患者中均出現MLT水平降低,提示下降的MLT水平與應激障礙密切相關。這些重要的應激相關激素及神經保護因子在許多應激障礙性疾病中作為神經內分泌變化的客觀指標用來反映機體的應激水平以及應激后發(fā)病機制的研究,但在白癜風患者中其表達水平如何尚未見報道。假設在白癜風患者中,血清應激相關激素及神經保護因子水平存在異常,那么理論上說通過糾正這些異常就有可能達到臨床治療白癜風的效果。 黑素細胞來源于神經嵴,是皮膚、毛發(fā)以及眼睛顏色的基礎,人類皮膚的顏色主要與表皮中黑素細胞合成黑素以及黑素傳遞至周圍角質形成細胞有關。黑素在黑素細胞的黑素小體中合成,由黑素合成的主要限速酶——酪氨酸酶催化酪氨酸生成多巴和多巴醌,再經過一系列反應而合成,然后再通過黑素細胞的樹突運輸到附近的角質形成細胞中,形成表皮的色素。酪氨酸酶是黑素合成的關鍵酶,是黑素細胞分化成熟的一個特征性標志,其活性與黑素合成含量呈正相關,因而增加黑素細胞數量、激活酪氨酸酶和加速黑素合成的治療手段對白癜風的復色有治療效果。但是目前白癜風動物模型尚不令人滿意,現行的動物實驗造模方式主要是5%過氧化氫脫色法,并不完全符合白癜風的病理變化,因此關于藥物治療白癜風作用機制的研究主要集中在體外試驗,觀察對黑素細胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素合成的影響。 目前“精神神經損傷與白癜風發(fā)病的關系”該研究領域的基礎仍較薄弱,可參考文獻不多,因此本課題盡量采用國內外公認的經典方法進行研究,從最基礎的流行病學調查開始做起。首先研究應激是否能對白癜風患者造成損傷以及白癜風患者患病后伴發(fā)的應激障礙是否明顯高于正常人；再進一步對白癜風患者應激相關的神經內分泌異常進行檢測,觀察白癜風患者應激效應激素——血清皮質酮(CORT)水平以及神經保護因子褪黑素(MLT)、腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)水平是否發(fā)生了變化,了解白癜風患者的應激反應狀態(tài)；隨后觀察地塞米松(Dex)、MLT、神經生長因子(NGF)對體外培養(yǎng)的正常人黑素細胞增殖及功能的影響。在此基礎上,結合白癜風免疫發(fā)病機制研究的最新進展,對上述三種藥物體外誘導正常人前體T淋巴細胞向Treg分化進行觀察,探討它們是否通過調控Treg水平而發(fā)揮治療作用。 中藥復方目前在國內白癜風治療中具有不可替代的地位,其中滋補肝腎、理氣活血類藥物是治療白癜風的最常用藥物。本研究以降低精神神經應激損傷為指導思想,對具有鎮(zhèn)靜安神作用的中藥復方治療白癜風的藥理機制進行了初步探索。在中藥中,酸棗仁重鎮(zhèn)養(yǎng)心安神,鉤藤疏肝驅風安神,是常用的調節(jié)神經功能障礙的單味中藥,本實驗中以滋補肝腎、理氣活血中藥復方——益氣活血合劑為基本方,分別加入酸棗仁及鉤藤,組成復方1號和復方2號,觀察藥物體外干預對黑素細胞增殖及黑素合成功能的影響。 已知患者血清中含有的許多物質和細胞因子對白癜風病情的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮著調控作用,文獻報道也證實加入患者血清后對體外培養(yǎng)的黑素細胞的增殖和功能都有不同程度的影響。為了解上述待篩選藥物在患者血清存在時對黑素細胞的作用,本研究還將待篩選藥物分別與治療前患者血清共同干預,觀察其對體外培養(yǎng)的正常人黑素細胞增殖與黑素合成的影響。 第一部分白癜風患者應激生活事件和應激損傷狀況調查 目的：1.調查白癜風患者發(fā)病前及病情復發(fā)前應激生活事件及應激損傷狀況； 2.對白癜風患者患病后伴發(fā)的常見應激障礙--焦慮或抑郁的發(fā)生率及嚴重程度進行評價與分析。 方法：采用病例對照方法,對55例白癜風患者和118例正常對照者進行流行病學量表調查與評定。應激生活事件調查采用楊德森生活事件量表(Life Event Scale, LES),內容包括生活事件發(fā)生與否、種類、性質、數量、影響程度及持續(xù)時間；焦慮評定采用漢密頓焦慮量表(Hamilton Anxiety Scale, HAMA)14項版本,抑郁評定采用漢密頓抑郁量表(Hamilton Depression Scale, HAMD)24項版本,根據評分值來評定焦慮或抑郁的發(fā)生情況及嚴重程度。 結果：1.應激生活事件數量：發(fā)病前或復發(fā)前1年內,除了社交方面總事件或負性事件數量,白癜風組低于正常對照組(P0.05),家庭方面、工作學習方面事件以及總事件數量,兩組差異均無顯著意義(P0.05), 2.應激生活事件評分：發(fā)病前或復發(fā)前1年內工作學習方面總事件及負性事件評分、總生活事件與總負性生活事件評分均值、工作學習方面總事件與負性事件評分均值,白癜風組均高于正常對照組(P0.05)。 3.應激障礙發(fā)生情況：焦慮及抑郁評分、肯定焦慮及肯定抑郁發(fā)生率、總焦慮及總抑郁發(fā)生率比較,白癜風組均高于正常對照組,差異有顯著意義(P0.05)。 結論：1.白癜風患者發(fā)病前或病情復發(fā)前接受的應激事件數量并不多于正常人,但某些類型的應激事件對患者造成的影響要顯著大于正常人,提示白癜風患者可能存在應激損傷易感基因,應激損傷可能在白癜風發(fā)病及病情復發(fā)中發(fā)揮作用。 2.白癜風患者焦慮或抑郁評分及發(fā)生率均高于正常人,提示白癜風患者患病后伴發(fā)應激障礙者多于正常人,表明應激障礙與白癜風發(fā)病密切相關。 第二部分白癜風患者血清中重要的應激相關激素及神經保護因子測定 目的：1.對白癜風患者血清中重要的應激相關激素水平及神經保護因子水平進行測定,了解白癜風患者的神經內分泌系統(tǒng)有無異常變化。 2.了解白癜風患者患病后伴發(fā)的應激障礙與神經內分泌異常之間的相關性。 方法：采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定90例病例組和87例對照組血清中應激相關激素神經肽Y (NPY)、促腎上腺皮質激素(ACTH)和皮質酮(CORT)水平以及血清神經保護因子褪黑素(MLT)和腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)水平。采用Pearson's相關性分析法對白癜風患者焦慮及抑郁評分與血清COR1、MLT、BDNF水平之間的關系進行分析。 結果：1.血清應激相關激素及神經保護因子水平：血清CORT水平比較,白癜風組(3.169±1.006)低于正常對照組(4.095±0.976),差異有顯著意義(t=6.210,P=0.000)；血清NPY水平比較,白癜風組(23.197±26.139)高于正常對照組(9.051±14.923),差異有顯著意義(t=4.401,P=0.000)；血清ACTH水平比較,白癜風組(981.821±432.091)高于正常對照組(549.54±342.36),差異有顯著意義(t=7.361,P=0.000)；血清MLT水平比較,白癜風組(61.513±28.193)低于正常對照組(75.497±35.576),差異有顯著意義(t=2.903,P=0.004)；血清BDNF水平比較,白癜風組(340.767±133.465)低于正常對照組(389.867±132.408),差異有顯著意義(t=2.306,P=0.022)。 2.應激最終的效應激素——血清CORT水平與其它應激相關激素及神經保護因子之間的相關性：對90例白癜風患者的測定結果進行分析,血清CORT水平與血清BDNF水平呈正相關(r=0.447,P=0.000),與NPY (r=0.189, P=0.074)、ACTH (r=0.089, P=0.404)、MLT (r=-0.064, P=0.546)水平無顯著相關。 3.神經內分泌異常與應激障礙之間的相關性：55例白癜風患者血清CORT水平與焦慮評分(r=-0.752,P=0.000)及抑郁評分(r=-0.626,P=0.000)呈負相關；血清BDNF水平與焦慮評分(r=-0.815,P=0.000)及抑郁評分(r=-0.571,P=0.000)也呈負相關；但患者血清MLT水平與焦慮評分(r=0.082,P=0.550)及抑郁評分(r=0.009,P=0.946)無顯著相關。 結論：1.白癜風患者存在應激效應激素——血清CORT水平降低,其上游的應激相關激素NPY、ACTH水平升高,提示患者的神經內分泌通路存在異常,并可能在該病發(fā)病過程中起重要作用,該結果也為糖皮質激素等內分泌激素治療白癜風提供了實驗依據。 2.白癜風患者中血清MLT、BDNF水平降低,糾正血清MLT、BDNF異常有可能成為臨床治療白癜風的一個新途徑。 3.白癜風患者的應激障礙與其血清CORT和BDNF水平呈顯著負相關。 第三部分調節(jié)應激障礙藥物對黑素細胞增殖與功能的影響 目的：1.了解待篩選藥物對體外培養(yǎng)的正常人MC增殖、Tyr活性及黑素含量的影響； 2.觀察Dex、MLT、NGF體外誘導Treg分化作用,對藥物作用機制進行初步探討。 方法：分別用cck-8法、多巴氧化法和NaOH法進行MC增殖、Tyr活性和黑素含量的檢測,磁珠分選正常人外周血中CD4+CD25-的前體T淋巴細胞,流式細胞儀檢測Treg比值。 結果：1.Dex、MLT、NGF對體外培養(yǎng)的MC的影響及體外誘導Treg分化的作用 1.1Dex、MLT、NGF單獨干預對MC的作用 與空白對照相比,地塞米松、NGF對MC增殖、Tyr活性和黑素含量均有顯著促進作用(P0.05)；而MLT對其無明顯影響(P0.05)。 1.2Dex、MLT、NGF分別與治療前患者15%血清共同干預對MC的作用 先對血清濃度進行篩選,發(fā)現2%、5%及10%血清促進MC細胞增殖,而15%及20%血清抑制MC增殖,故選取15%血清進行后面的實驗。與健康人(51.912±6.080)相比,加入患者血清后,MC增殖率顯著增高(P0.01)；與治療前(76.904±9.519)相比,治療后患者血清(98.065±14.079)對MC增殖有顯著促進作用(t=3.980,P=0.011)。 與治療前患者血清共同干預,NGF對MC增殖、Tyr活性和黑素含量均有顯著促進作用(P0.05)；地塞米松對MC增殖和黑素含量有顯著促進作用(P0.05),對Tyr活性無明顯影響(P0.05)；而MLT對MC增殖Tyr活性和黑素含量均無明顯影響(P0.05)。 1.3Dex、MLT、NGF體外誘導Treg分化 與空白對照(5.390±0.082)相比,NGF組(6.170±0.104)促進前體T淋巴細胞向Treg分化(t=17.298,P=0.003),Dex組(4.140±0.573)抑制前體T淋巴細胞向Treg分化(t=4.348,P=0.049),MLT組(5.880±0.219)對體外誘導Treg分化無顯著影響(t=3.500,P=0.073)。 2.中藥對體外培養(yǎng)的Mc的影響 2.1中藥單獨干預對MC的作用 與空白對照相比,益氣活血合劑對MC增殖和黑素含量有顯著促進作用(P0.05),對Tyr活性無明顯影響；復方1號及復方2號對Tyr活性和黑素含量有顯著促進作用(P0.05),對MC增殖無明顯影響；但復方1號(169.679±31.862)及復方2號(139.458±20.926)分別與益氣活血合劑(148.193±19.738)相比,對黑素含量的影響并無顯著差異(P0.05)。 進一步對組方中各單味藥的作用分別進行檢測。①對MC增殖的影響：黃芪、雞血藤使MC增殖率增高,鉤藤使MC增殖率降低(P0.05)；②對Tyr活性的影響：丹參、酸棗仁能增強Tyr活性(P0.05)；③對MC黑素合成的影響：黃芪、丹參、酸棗仁使黑素含量增高(P0.05),而雞血藤、鉤藤對黑素含量無顯著影響(P0.05)。 2.2中藥分別與治療前患者15%血清共同干預對Mc的作用 共同干預時,益氣活血合劑使MC增殖率增高,但對Tyr活性和黑素含量無明顯作用,而復方1號及復方2號對MC增殖、Tyr活性和黑素含量均有顯著促進作用(P0.05)；與益氣活血合劑相比,復方2號能顯著增加黑素含量(t=3.811,P=0.012)。 結論：1.NGF對MC增殖、Tyr活性與黑素合成均有顯著促進作用,且對體外誘導Treg分化有促進作用,提示有較好的臨床應用前景。 2.藥物既可以通過促進MC增殖途徑(如Dex、黃芪、益氣活血合劑),也可以通過增強Tyr活性(如丹參、酸棗仁、復方1號、復方2號)而增加黑素含量。 3.復方1號、復方2號與血清共同干預時對MC增殖、Tyr活性及黑素含量均有顯著促進作用,提示這兩種復方在體內促黑素合成功效可能更好。 4.理氣活血方劑加入鎮(zhèn)靜安神類藥物鉤藤可以增強促黑素合成功效。 5.與健康人15%血清相比,患者血清對MC增殖有顯著促進作用,表明患者血清中既有致病因子,也有各種促進恢復或維穩(wěn)的調控因子,各種因子相互影響,組成一個復雜精妙的調控網絡,其共同作用的綜合效果決定著疾病的發(fā)生和轉歸。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R758.41

【參考文獻】

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本文編號：1798382