本文選題：特應(yīng)性皮炎 + Nc/Nga小鼠�。� 參考：《中南大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 前言 特應(yīng)性皮炎(AD)是一種常見的瘙癢性皮膚病,通常與過敏性鼻炎和哮喘等過敏性疾病相關(guān)。60%的特應(yīng)性皮炎病例出現(xiàn)在出生后第1年,嬰兒期,濕疹樣皮損通常開始為頰部紅斑和脫屑,抓痕常在數(shù)星期后出現(xiàn),伴隨糜爛結(jié)痂。兒童期皮損好發(fā)于摺縫、項(xiàng)背、以及四肢的伸側(cè),表現(xiàn)為苔蘚化、浸潤性斑塊。青春期及成人期,苔蘚樣皮損常影響四肢屈側(cè)、頭和頸部。在每一個(gè)階段,都會(huì)出現(xiàn)不同程度的瘙癢,夜間加重,從而導(dǎo)致睡眠不足,進(jìn)而嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量。AD病情的嚴(yán)重程度、復(fù)發(fā)率在不斷加劇,引起了廣大學(xué)者的研究興趣,但是到目前為止其確切的發(fā)病機(jī)制還不十分清楚,臨床治療比較棘手。因此研究AD的發(fā)病機(jī)理及尋找治療藥物是十分必要的。 根據(jù)1986年Mosman等提出的細(xì)胞分型理論,人類CD4+T細(xì)胞按其功能可分為Th1和Th2亞群,Th1/Th2細(xì)胞通過分泌不同的細(xì)胞因子發(fā)揮免疫作用。Th1細(xì)胞能產(chǎn)生IL-12, IFN-γ,主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫及遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng),參與細(xì)菌或病毒感染的炎癥反應(yīng)。而Th2細(xì)胞則分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13,參與以促進(jìn)嗜酸粒細(xì)胞聚集為特征的IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng),在過敏或變態(tài)反應(yīng)中起重要作用。正常情況下Th1、Th2產(chǎn)生的細(xì)胞因子相互拮抗對方的功能,達(dá)到平衡。 越來越多的研究報(bào)道表明,AD患者的皮損及血中Th2型細(xì)胞因子占優(yōu)勢。IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13水平升高,IFN-γ和IL-12降低,這種細(xì)胞因子環(huán)境更有利于促進(jìn)Th2細(xì)胞發(fā)育,抑制Th1細(xì)胞分化。IL-4能促進(jìn)B細(xì)胞分化增殖,是人體內(nèi)合成IgE并使IgE維持一定濃度的必需細(xì)胞因子。IL-12能促進(jìn)Th1的分化和增殖,促進(jìn)T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞發(fā)育與增殖,并刺激這些細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。有學(xué)者證實(shí)健康者及AD患者中IFN-γ能抑制IL-4介導(dǎo)的IgE產(chǎn)生。隨著AD患者臨床癥狀的改善,血漿內(nèi)IFN-γ的水平上升。由此可見通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子之間的Th1/Th2平衡,抑制Th2優(yōu)勢應(yīng)答,對治療AD有重要的意義。 卡介菌多糖核酸(polysaccharide nucleic acid fraction of bacillus calrnette guerin, BCG-PSN)是從卡介菌中經(jīng)熱酚法提取多糖、核酸而制成的新型免疫調(diào)節(jié)劑,臨床研究顯示應(yīng)用BCG-PSN治療過敏性鼻炎、哮喘、慢性蕁麻疹等過敏性疾病取得了滿意的療效。但對于治療特應(yīng)性皮炎的基礎(chǔ)研究和對樹突狀細(xì)胞的影響尚未見報(bào)道。為此,本研究利用NC/Nga小鼠作為AD小鼠模型,觀察BCG-PSN對NC/Nga小鼠皮炎嚴(yán)重程度、搔抓頻率、耳朵厚度、血漿內(nèi)IgE、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ蛋白水平和脾臟組織IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γmRNA表達(dá)的影響,旨在探討B(tài)CG-PSN對Nc/Nga小鼠皮損的治療作用及其作用機(jī)制。培養(yǎng)小鼠樹突狀細(xì)胞(DC2.4細(xì)胞株),觀察不同劑量BCG-PSN對小鼠DC2.4細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞膜表面分子MHC-Ⅱ、CD83、CD86蛋白表達(dá)、上清液中IL-12、IL-10蛋白水平和DC2.4細(xì)胞IL-12、IL-10 mRNA表達(dá)的影響；抗TLR2、4、9抗體預(yù)處理DC2.4細(xì)胞1h后,觀察BCG-PSN對DC2.4細(xì)胞分泌IL-12蛋白和IL-12p40 mRNA的影響；NF-KB抑制劑PDTC預(yù)處理DC2.4細(xì)胞1h,觀察BCG-PSN對其表面分子DC83、MHC-Ⅱ表達(dá)、IL-12分泌以及NF-κB RelB/p50的影響,旨在探討B(tài)CG-PSN對樹突狀細(xì)胞的生物學(xué)作用并明確其信號(hào)傳導(dǎo)通路。通過對新生Nc/Nga小鼠早期多次注射不同劑量的BCG-PSN,觀察Nc/Nga小鼠成年后特應(yīng)性皮炎樣皮損、皮炎評(píng)分、搔抓頻率、外周血血漿IgE的濃度以及脾臟單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-12的蛋白水平,觀察背部皮損組織病理學(xué)變化和免疫組化檢測IFN-γ蛋白的表達(dá)強(qiáng)度,旨在探討早期多次注射BCG-PSN對Nc/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎樣皮損的預(yù)防作用及其可能機(jī)制。 目的研究BCG-PSN對特應(yīng)性皮炎動(dòng)物模型Nc/Nga小鼠的治療作用及其可能機(jī)制。 方法20只7周齡Nc/Nga雌鼠隨機(jī)平均分成4組：對照組、模型組、BCG-PSN組、DXM組。皮炎模型建立：鼠齡7周,對照組小鼠足墊及除毛之后腹部外涂丙酮溶液100μl,模型組、BCG-PSN組和DXM組小鼠足墊及除毛之后腹部外涂含5%DNCB的丙酮溶液100μl；鼠齡8-13周,對照組耳朵皮膚外涂丙酮溶液100μl,模型組、BCG-PSN組和DXM組小鼠耳部皮膚涂抹含0.1%DNCB的丙酮溶液100μl,每周1次。給藥：對照組和模型組腹腔注射生理鹽水100μl,BCG-PSN組按0.5mg/kg腹腔注射BCG/PSN, DXM組按0.1mg/kg腹腔注射DXM,每周1次,共7周。每周計(jì)數(shù)1次10min內(nèi)Nc/Nga小鼠搔抓次數(shù)并利用游標(biāo)卡尺測量小鼠耳朵厚度,末次給藥后眼球摘除取血、無菌取脾臟,甲醛固定耳部組織,制作石蠟包塊。ELISA檢測血漿內(nèi)IgE和IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ的蛋白水平,實(shí)時(shí)定量rt-PCR檢測脾臟組織中IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γmRNA的表達(dá)水平,石蠟包塊切片行HE染色分析耳部組織皮損炎癥程度。 結(jié)果(1)各實(shí)驗(yàn)組小鼠耳朵皮損及組織病理學(xué)變化：對照組小鼠毛發(fā)光亮,無明顯皮損產(chǎn)生,組織病理示稀疏淋巴細(xì)胞浸潤,輕度角化。模型組小鼠雙側(cè)耳朵出現(xiàn)腫脹、紅斑、滲出、表皮剝脫、結(jié)痂等表現(xiàn),皮損組織病理可見角化過度、灶性角化不全、棘層肥厚、輕度海綿水腫、真皮內(nèi)有大量淋巴細(xì)胞伴漿細(xì)胞浸潤,血管擴(kuò)張充血。BCG-PSN組紅斑、滲出較模型組減輕,皮損組織病理僅表現(xiàn)為輕微角化過度、輕度海綿水腫、真皮淺層少量炎性細(xì)胞浸潤,DXM組耳朵腫脹較模型組減輕,皮損組織炎癥細(xì)胞浸潤減少。(2)各實(shí)驗(yàn)組小鼠耳朵厚度及搔抓行為：模型組小鼠耳朵厚度及搔抓頻率與對照組相比,明顯增高。BCG-PSN組和DXM組與模型組相比,均可降低DNCB致敏所致小鼠耳朵增厚和搔抓行為,BCG-PSN與DXM之間無差異。(3)與對照組相比,模型組小鼠血漿內(nèi)IgE、IL-4和IL-10增高,脾臟組織IL-4和IL-10mRNA的表達(dá)增高。BCG-PSN可以提高血漿內(nèi)IL-12和IFN-γ蛋白濃度和脾臟組織IL-12p40和IFN-γmRNA的表達(dá),抑制Nc/Nga小鼠血漿內(nèi)IgE的水平。DXM可降低血漿內(nèi)IgE水平,增加IL-10的含量,減少IL-4、IL-12、IFN-γ表達(dá)。 結(jié)論我們外用DNCB致敏Nc/Nga小鼠成功建立小鼠特應(yīng)性皮炎模型；BCG-PSN主要通過降低IgE水平、增加IL-12和IFN-γ,對Nc/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎樣皮損產(chǎn)生抑制作用。 目的研究BCG-PSN對小鼠樹突狀細(xì)胞(DC2.4細(xì)胞株)分泌細(xì)胞因子IL-10、IL-12和細(xì)胞表面MHC-Ⅱ、CD83、CD86蛋白表達(dá)的影響。 方法用終濃度5μg/ml、20μg/ml、50μg/ml BCG-PSN刺激小鼠DC2.4細(xì)胞,48h后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞儀檢測主要組織相容性復(fù)合物類分子(MHC-Ⅱ)及協(xié)同刺激分子CD83、CD86蛋白表達(dá)水平,ELISA方法檢測上清液中IL-12、IL-10的蛋白含量,實(shí)時(shí)定量RT-PCR測定IL-10、IL-12p40 mRNA的表達(dá)情況；抗TLR2、TLR4、TLR9抗體分別預(yù)處理DC2.4細(xì)胞1h后,ELISA方法檢測培養(yǎng)細(xì)胞上清液中IL-12的蛋白含量,實(shí)時(shí)定量RT-PCR測定IL-12p40mRNA的表達(dá)情況；PDTC預(yù)處理DC2.4細(xì)胞1h,觀察BCG-PSN對其表面分子DC83、MHC-Ⅱ表達(dá)及IL-12分泌的影響,并檢測NF-κBRelB/p50的活性。 結(jié)果不同濃度BCG-PSN與DC2.4細(xì)胞共同培育后,細(xì)胞體積增大。細(xì)胞突觸增粗并隨BCG-PSN濃度增高而增多；5μg/ml、20μg/ml、50μg/ml BCG-PSN組DC2.4細(xì)胞表面共刺激分子CD83和組織相容性復(fù)合物MHC-Ⅱ分子表達(dá)水平高于空白對照組(P0.05),CD86在各組細(xì)胞均為高度表達(dá),組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。DC2.4細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12隨BCG-PSN濃度的增加而增加,與對照組相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,BCG-PSN可以促進(jìn)IL-12p40 mRNA表達(dá),呈劑量依賴性�？筎LR4抗體預(yù)處理后,IL-12分泌和IL-12p40 mRNA表達(dá)減少,與對照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,抗TLR2或抗TLR9抗體預(yù)處理對BCG-PSN的作用沒有影響。PDTC預(yù)處理DC2.4細(xì)胞,可以阻斷BCG-PSN促DC2.4細(xì)胞IL-12p40基因轉(zhuǎn)錄的作用,培養(yǎng)細(xì)胞上清液中IL-12的含量沒有增加。 結(jié)論BCG-PSN可促進(jìn)DC2.4細(xì)胞CD83、MHC-Ⅱ的表達(dá),增加IL-12的分泌；DC2.4細(xì)胞通過TLR4受體識(shí)別BCG-PSN,繼而激活NF-κB,從而促進(jìn)IL-12p40基因轉(zhuǎn)錄。 目的研究早期多次注射BCG-PSN對Nc/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎樣皮損的預(yù)防作用并探討其可能的機(jī)制。 方法新生Nc/Nga小鼠隨機(jī)分為3組：對照組(n=4)、0.1mg/kg BCG-PSN組(n=5)、0.5mg/kg BCG-PSN組(n=7)。BCG-PSN各組在出生后第1、8、15、22天分別皮下注射0.1mg/kg和0.5mg/kg的BCG-PSN,對照組以等量的生理鹽水代替；鼠齡第48天,8%的硫化鈉脫去背部鼠毛；鼠齡第49天,用1%DNCB致敏小鼠,鼠齡第56、63、70天外用0.1%DNCB進(jìn)行激發(fā)；第57、64、71天進(jìn)行皮炎評(píng)分拍照、眶后靜脈采血、觀察并記錄搔抓行為,第72天處死小鼠并收集血漿、脾臟和背部皮損組織。ELISA方法檢測血漿中IgE的濃度和脾臟單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4和IL-12的濃度,免疫組化觀察皮損中IFN-γ的表達(dá),HE染色觀察皮損組織病理學(xué)改變。 結(jié)果早期重復(fù)注射BCG-PSN,可以顯著改善DNCB致敏Nc/Nga小鼠皮損炎癥程度,降低皮炎評(píng)分以及小鼠的搔抓行為,不同劑量BCG-PSN組之間搔抓頻率無差異。BCG-PSN可以降低血漿中IgE的含量,呈劑量依賴性。0.5mg/kgBCG-PSN可增加皮損中分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量。不同劑量BCG-PSN均可降低脾單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4的含量,增加IL-12的濃度。 結(jié)論早期注射BCG-PSN可通過促進(jìn)分泌IFN-γ細(xì)胞的增生,增加IL-12合成,降低IL-4和IgE的含量,從而有效減輕Nc/Nga小鼠皮炎嚴(yán)重程度。
[Abstract]:Foreword



AD is a common skin disease , which is usually associated with allergic rhinitis and allergic diseases such as allergic rhinitis and asthma . 60 % of atopic dermatitis occurs in the first year of birth , the infant stage , eczema - like skin loss usually starts to be the buccal erythema and dechippings , which often affects the patient ' s life quality . The severity and recurrence rate of AD are not very clear , and the clinical treatment is difficult . Therefore , it is very necessary to study the pathogenesis of AD and to find therapeutic drugs .



Th1 / Th2 cells secrete IL - 12 , IL - 5 , IL - 6 , IL - 10 and IL - 13 . Th1 cells secrete IL - 4 , IL - 5 , IL - 6 , IL - 10 and IL - 13 . Th1 and Th2 cytokines secrete IL - 4 , IL - 5 , IL - 6 , IL - 10 and IL - 13 .



IL - 4 , IL - 5 , IL - 6 , IL - 10 and IL - 13 levels increased , IFN - 緯 and IL - 12 decreased , and IL - 4 stimulated the differentiation and proliferation of Th1 cells .



In this study , the effects of BCG - psn on the skin loss of NC / Nga mice , the expression of IL - 4 , IL - 10 , IL - 12 , IFN - 緯 protein and the expression of IL - 4 , IL - 10 , IL - 12 , IFN - 緯 mRNA and IL - 4 , IL - 10 , IL - 12 , IFN - 緯 mRNA in mice were observed .
The effects of BCG - psn on IL - 12 and IL - 12p40 mRNA were observed after 1 hour pretreatment with anti - TLR2 , 4 , 9 antibody .
The effects of BCG - psn on the biological function of dendritic cells and the expression intensity of IL - 4 and IL - 12 were observed .



Objective To study the therapeutic effect and possible mechanism of BCG - psn on the mice model of atopic dermatitis .



Methods Twenty seven - week - old NC / Nga female rats were randomly divided into four groups : control group , model group , BCG - psn group and DXM group . The dermatitis model was established : mouse age 7 weeks , control group mouse foot pad and abdominal external application acetone solution 100渭l , model group , BCG - psn group and DXM group mouse foot pad and acetone solution with 5 % DNCB after wool removal ;
The levels of IL - 4 , IL - 10 , IL - 12 , IL - 12 , IFN - 緯 in spleen were measured by ELISA . The levels of IL - 4 , IL - 10 , IL - 12 , IFN - 緯 mRNA in spleen tissues were measured by ELISA .



Results ( 1 ) The skin loss and histopathological changes of mouse ear in the experimental group were significantly higher than those in the control group . There was no difference between the concentration of IL - 12 and IL - 10 and the expression of IL - 12p40 and IL - 10 mRNA in mice .



Conclusion We have successfully established the mouse atopic dermatitis model with DNCB - sensitized NC / Nga mice .
BCG - psn increased the level of IgE , increased IL - 12 and IFN - 緯 , and had an inhibitory effect on the skin loss of atopic dermatitis in NC / Nga mice .



Objective To investigate the effects of BCG - psn on the expression of IL - 10 , IL - 12 and MHC - 鈪，

本文編號(hào)：1796144