本文選題：MM + c-FLIP��； 參考：《華中科技大學》2010年博士論文

【摘要】： 第一部分c-FLIP在黑素瘤組織中的表達及其與臨床病理特征的關系 目的檢測c-FLIP在黑素瘤組織及細胞系中的表達,探究其與臨床病理特征之間的關系。 方法免疫組化方法檢測c-FLIP在77例黑素瘤組織及23例色素痣組織中的表達；并檢測其在34例CA和16例正常包皮組織中的表達,同時用western blotting和RT-PCR檢測了其分別在CA和正常包皮組織中的蛋白表達和mRNA水平。western blotting和流式細胞術檢測c-FLIP在A375, A875, SK-Mel-1和SK-Mel-28黑素瘤細胞系中的表達。 結(jié)果c-FLIP在惡性黑素瘤組織中的表達明顯高于在色素痣中的表達,其高表達與組織病理學分型相關并與黑素瘤的Clark's分級相關。與Ki-67標記指數(shù)(KI)高度相關。四株黑素瘤細胞中,A875細胞的c-FLIP的表達最高。c-FLIP在CA中的蛋白和mRNA水平均較正常包皮組織中的明顯增高。 結(jié)論c-FLIP除了具有抗凋亡功能外,它還具有促增殖作用,在惡性黑素瘤的侵襲性生物學特性中可能具有重要的作用,對惡性黑素瘤的預后具有重要意義。c-FLIP在CA中的高表達可能與角質(zhì)形成細胞的過度增殖有關。 第二部分c-FLIPshRNA載體的構(gòu)建及鑒定 目的構(gòu)建針對c-FLIP不同亞型的shRNA真核表達載體c-FLIPT/L/S shRNA,鑒定其正確性,并轉(zhuǎn)染惡性黑素瘤A875細胞系,證實其在體外培養(yǎng)的惡性黑素瘤細胞中對c-FLIP具有干擾作用。 方法①人工合成互補并編碼相應短發(fā)夾狀c-FLIPT/L/S shRNAs的寡核苷酸鏈,將其插入到Pgenesil-1載體中,經(jīng)酶切和測序鑒定所構(gòu)建的重組體是否正確；②采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、Western blot和流式細胞術分別檢測轉(zhuǎn)染的A875細胞中c-FLIP mRNA和蛋白的表達變化。③在人惡性黑素瘤細胞系A875中,用G418篩選沉默效果最佳的c-FLIPshRNAs,用流式細胞術(FCM)檢測GFP的表達,鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆細胞系。 結(jié)果①經(jīng)酶切和測序證明c-FLIPT/L/S shRNAs序列正確；②A875細胞系中轉(zhuǎn)染c-FLIPT/L/S shRNAs載體后,c-FLIPT1shRNA和c-FLIPT1shRNA沉默效果最佳。③熒光顯微鏡下觀察到了G418篩選穩(wěn)定表達c-FLIPT1shRNA的A875細胞,FCM檢測GFP表達均在96%以上。 結(jié)論測序結(jié)果表明發(fā)卡樣的c-FLIPT/L/S shRNAs真核表達載體構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)染A875細胞后獲得穩(wěn)定表達,并可特異性封閉c-FLIPT/L/S的表達,篩選和鑒定出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克隆細胞系A875,為后續(xù)實驗及進一步研究c-FLIPT/L/S shRNAs載體在惡性黑素瘤治療中的作用提供了理論基礎。 第三部分c-FLIP的下調(diào)誘導惡性黑素瘤A875細胞系JNK信號途徑的活化 目的觀察c-FLIP不同亞型shRNA對惡性黑素瘤A875細胞系JNK信號途徑的影響。 方法western blot檢測c-FLIPT/L/S shRNAs真核表達載體穩(wěn)轉(zhuǎn)的A875細胞系中p-JNK表達水平。 結(jié)果與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的A875細胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染c-FLIPC shRNA真核表達載體的A875細胞相比,c-FLIPT/LshRNAs真核表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A875細胞系中p-JNK表達水平明顯升高,而c-FLIPS-shRNA真核表達載體穩(wěn)轉(zhuǎn)的A875細胞系中p-JNK表達水平無明顯變化。 結(jié)論在黑素瘤細胞系中下調(diào)c-FLIP (c-FLIPL)的表達可以誘導JNK信號途徑的活化。 第四部分c-FLIP不同亞型shRNA對惡性黑素瘤細胞生物學特性的影響 目的觀察c-FLIP各亞型shRNA對A875細胞的生長、增殖及凋亡的影響。 方法在c-FLIPT/L/S/C shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A875細胞中,運用絕對細胞計數(shù)對c-FLIP各亞型shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞繪制生長曲線,比較其與對照組的差異；用MTT法檢測各穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞增殖能力的差異；用Annexin v/PI雙染細胞,檢測各組細胞凋亡率的差異。 結(jié)果穩(wěn)定轉(zhuǎn)染c-FLIPT/L/sshRNAA875細胞生長速度較未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的A875細胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染c-FLIPC shRNA A875細胞的生長速度慢,進入對數(shù)生長期的時間延長且平臺降低。與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的A875細胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染c-FLIPC shRNA真核表達載體的A875細胞相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染c-FLIPT/L/S shRNA真核表達載體的A875細胞光密度值明顯降低。運用Annexin v/PI雙染,流式細胞術檢測細胞凋亡顯示與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的A875細胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染c-FLIPc shRNA真核表達載體的A875細胞相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染c-FLIPT/L/S shRNA真核表達載體的A875細胞凋亡率明顯增加。 結(jié)論靶向c-FLIP基因不同亞型的shRNA不僅對黑素瘤細胞的生長和增殖具有抑制作用,而且能夠促進黑素瘤的凋亡。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R739.5

【參考文獻】

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本文編號：1769234