本文選題：5-氨基酮戊酸 + 光動(dòng)力療法�。� 參考：《揚(yáng)州大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：目的： 1、構(gòu)建HPV16E7基因轉(zhuǎn)染角質(zhì)形成細(xì)胞系,將該細(xì)胞系作為觀察ALA-PDT對(duì)HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡途徑影響的研究模型。 2、探討HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞的最佳ALA孵育時(shí)間和ALA光動(dòng)力診斷(photodynamic diagnosis, PDD)診斷HPV感染性疾病的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 3、研究ALA-PDT對(duì)HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞殺傷的作用機(jī)制,明確ALA-PDT誘導(dǎo)HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡通路,進(jìn)一步將ALA-PDT推廣應(yīng)用于治療HPV攜帶者和亞臨床感染與潛伏感染的患者。 方法： 1、利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出CaSki細(xì)胞中的HPV16E7基因.再用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后定向克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/HPV16E7,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HaCaT細(xì)胞,經(jīng)G418篩選穩(wěn)定表達(dá)HPV16E7蛋白的HaCaT細(xì)胞株；利用cck8檢測HaCaT/E7細(xì)胞的生長曲線；應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察HaCaT, HaCaT/E7和HaCaT/pcDNA3.1三種細(xì)胞形態(tài)。 2、最適ALA濃度1mM(前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果)孵育HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞后,采用Biotek酶標(biāo)儀檢測連續(xù)八小時(shí)內(nèi)的HaCaT/E7細(xì)胞PpIX熒光強(qiáng)度,得出HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞的最佳ALA孵育時(shí)間和ALA光動(dòng)力診斷(photodynamic diagnosis, PDD)用于診斷HPV感染性疾病的最佳時(shí)間點(diǎn)。 3、在最佳ALA孵育時(shí)間(Optimal time)點(diǎn),采用磷脂結(jié)合蛋白Ⅴ (Annexin Ⅴ)/碘化丙錠(PI)雙染法通過流式細(xì)胞術(shù)檢測同一劑量(8J/cm2) ALA-PDT后不同時(shí)間點(diǎn)(連續(xù)8個(gè)小時(shí)),以及不同劑量(OJ/cm2,4J/cm2,8J/cm2,10J/cm2,12J/cm2,16J/cm2和20J/cm2) ALA-PDT后同一時(shí)間點(diǎn)(3小時(shí))對(duì)HaCaT/E7細(xì)胞凋亡及壞死的比例。 4、采用陽離子脂質(zhì)熒光探針JC-1(5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethy-benzimi dazol-carbocyanine iodide,四氯四乙基苯并咪唑羰花青)檢測ALA-PDT前后HaCaT/E7細(xì)胞株線粒體跨膜電位的變化。 5、利用western blot技術(shù)研究ALA-PDT對(duì)HaCaT/E7細(xì)胞cytichrome c和Caspase9/3表達(dá)的影響。 6、半定量逆轉(zhuǎn)錄酶-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及Real time PCR檢測ALA-PDT對(duì)HaCaT/E7細(xì)胞凋亡基因Caspase9、.3mRNA表達(dá)的調(diào)控。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)HPV16E7蛋白的HaCaT細(xì)胞株：Western blotting檢測可見E7蛋白條帶,巢式RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后檢測到HPV16E7mRNA表達(dá)的特異性297bp條帶,HaCaT, HaCaT/E7和HaCaT/pcDNA3.1三種細(xì)胞形態(tài)無明顯改變,HaCaT/E7細(xì)胞呈現(xiàn)明顯生長優(yōu)勢。 2.ALA處理培養(yǎng)細(xì)胞及原卟啉Ⅸ (PpⅨ)熒光動(dòng)力學(xué)研究：HaCaT, HaCaT/E7和HaCaT/pcDNA3.1三組細(xì)胞的PpⅨ峰值時(shí)間均為5小時(shí),3小時(shí)與對(duì)照組相比出現(xiàn)明顯增高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),HaCaT/E7組的PpⅨ熒光強(qiáng)度普遍高于對(duì)照HaCaT組,HaCaT/pcDNA3.1組熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)最高；一小時(shí)三組細(xì)胞PpⅨ熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 3. Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測HaCaT/HPV16E7細(xì)胞凋亡百分率顯示：同一時(shí)間ALA-PDT后3小時(shí),隨著光劑量的增加,HaCaT/E7細(xì)胞的的凋亡和壞死明顯增加,小劑量以凋亡為主,大劑量以壞死為主；同一劑量8J/cm2的照射劑量ALA-PDT后,HaCaT/E7細(xì)胞在連續(xù)8個(gè)小時(shí)內(nèi)凋亡和壞死總量不斷增加。 4.陽離子脂質(zhì)熒光探針JC-1顯示：ALA-PDT后HaCaT/HPV16E7細(xì)胞株線粒體跨膜電位崩塌細(xì)胞比例明顯增加,隨著劑量和時(shí)間增加,這種細(xì)胞比例逐步增多,呈一定的劑量和時(shí)間依賴性,共聚焦顯微鏡下可見隨著ALA-PDT后時(shí)間延長,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,顯示線粒體跨膜電位下降的發(fā)生早于形態(tài)學(xué)改變,也早于磷酯酰絲氨酸暴露于細(xì)胞表面。 5.半定量比較western blotting結(jié)果顯示：HaCaT/HPV16E7細(xì)胞ALA-PDT后Caspase-3、Caspase-9及活化片段蛋白表達(dá)量明顯上調(diào),在從8J/cm2照射劑量和治療后3小時(shí)達(dá)到高峰。 6. Real time RT-PCR均顯示：ALA-PDT對(duì)HaCaT/HPV16E7細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、 Caspase-9的基因表達(dá)量無明顯影響,統(tǒng)計(jì)學(xué)無明顯差異(P0.05)。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了HPV16E7轉(zhuǎn)染角質(zhì)形成細(xì)胞的模型,為目前尚缺乏HPV感染動(dòng)物模型情況下,提供新的研究思路和尋求新的研究技術(shù)。 2.通過對(duì)細(xì)胞原卟啉Ⅸ的研究,從細(xì)胞學(xué)水平上輔助證明了臨床上用于光動(dòng)力治療HPV感染性疾病的的最佳封包時(shí)間為3-5小時(shí),而用于光動(dòng)力診斷時(shí)間可為1小時(shí)。 3.ALA光動(dòng)力誘導(dǎo)HPV感染細(xì)胞以壞死和凋亡兩種方式引起死亡,小劑量的光動(dòng)力主要以凋亡為主,而大劑量的光動(dòng)力以壞死為主,呈一定的時(shí)間依賴性。 4.ALA介導(dǎo)的PDT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可改變線粒體膜電位,膜電位的改變?cè)缬诩?xì)胞形態(tài)和磷酯酰絲氨酸暴露于細(xì)胞表面,提示凋亡與線粒體的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。 5. ALA-PDT可上調(diào)HaCaT/HPV16E7細(xì)胞中Caspase-9、Caspase-3活化片段蛋白表達(dá)量,證明其誘導(dǎo)HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡途徑主要通過線粒體途徑。 6. ALA-PDT對(duì)HaCaT/HPV16E7細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-9的基因表達(dá)量無明顯影響,顯示其介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑發(fā)揮可能未通過基因水平而僅在蛋白質(zhì)水平。
[Abstract]:Purpose :

1 . The human papillomavirus type 16E7 gene was transfected into keratinocytes to form a cell line , and the cell line was used as a model to observe the effect of ALA - PDT on the apoptotic pathway of HPV infected keratinocytes .

2 . To investigate the optimal ALA incubation time of HPV infected keratinocytes and the diagnosis of HPV infectious diseases by ALA photodynamic diagnosis .

3 . The mechanism of ALA - PDT on the killing of HPV infected keratinocytes was studied . The apoptotic pathway of the keratinocytes was induced by ALA - PDT , and the ALA - PDT was further extended to the patients with HPV carrier and subclinical infection and latent infection .

Method :

1 . The HPV16E7 gene was amplified by RT - PCR . The recombinant plasmid pcDNA3.1 ( + ) / HPV16E7 was cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1 ( + ) by restriction of EcoR鈪，

本文編號(hào)：1752139