本文選題：鱗狀細(xì)胞癌(SCC) + 鼠雙倍突變體基因2(MDM2)��； 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景:皮膚癌是最常見的惡性腫瘤之一。它大體上可以分為惡性黑素瘤和非黑素瘤性皮膚癌(NMSC),NMSC主要包括鱗狀細(xì)胞癌(SCC)和基底細(xì)胞癌。近年來皮膚癌的發(fā)病率呈上升趨勢,從而成為了一個全球性的公共衛(wèi)生問題。SCC主要發(fā)生于老年人,50-60歲為發(fā)病高峰,男性多于女性,好發(fā)于頭頸、面部和手背等暴露部位。SCC為起源于表皮或皮膚附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞的一種惡性腫瘤,常發(fā)生于某些皮膚癌前疾病基礎(chǔ)上,或由各種癌前疾病演變而來。SCC細(xì)胞惡變病因不清,但與以下因素明確相關(guān):(1)紫外線照射;(2)化學(xué)致癌因素;(3)癌前病變;(4)瘢痕外傷和其他慢性皮膚病;(5)免疫抑制。其中紫外線照射是皮膚癌發(fā)生的主要原因。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明,在發(fā)展到惡性腫瘤發(fā)生之前往往需要累積紫外線過度照射幾年或幾十年。保護人體皮膚免受紫外線輻射的最重要的防御機制涉及黑色素的合成,并積極修復(fù)機制。SCC在組織病理學(xué)上表現(xiàn)為侵襲性生長,自表皮向下突破基底層侵入真皮,呈條索狀和不規(guī)則團塊狀,由正常鱗狀細(xì)胞和非典型鱗狀細(xì)胞組成。前者分化好,可形成角質(zhì)形成細(xì)胞,后者分化不好,即所謂癌細(xì)胞。向角化方向分化的癌細(xì)胞內(nèi)常見角珠及角化不良細(xì)胞。已分化的鱗狀細(xì)胞可見細(xì)胞間橋。未分化和低分化的鱗狀細(xì)胞體積較小,無細(xì)胞間橋和角化不良細(xì)胞。Broders根據(jù)未分化癌細(xì)胞所占百分比,結(jié)合癌細(xì)胞的非典型程度與損害的侵襲程度將SCC分為4級。Ⅰ級SCC(即高分化鱗癌):SCC內(nèi)含低于25%非典型鱗狀細(xì)胞,向下侵犯真皮但不超過真皮中部汗腺水平,SCC團塊中角珠多見,中心可完全或部分角化,邊緣斷續(xù)可見基底層細(xì)胞,與周圍間質(zhì)無明顯分界,SCC周圍真皮內(nèi)有明顯炎癥反應(yīng),一般不發(fā)生轉(zhuǎn)移。Ⅱ級SCC: SCC內(nèi)含25%-50%非典型鱗狀細(xì)胞,向下侵犯至真皮深處,SCC團塊中角珠少見,中心角化程度輕、多見角化不全,與周圍間質(zhì)無明顯分界,SCC周圍真皮內(nèi)炎癥反應(yīng)輕。Ⅲ級SCC: SCC內(nèi)含50%～70%非典型鱗狀細(xì)胞,SCC團塊中不見角珠,中心角化程不明顯,細(xì)胞核不典型,有絲分裂象顯著,SCC周圍真皮內(nèi)炎癥反應(yīng)不明顯。Ⅳ級Scc(即低分化鱗癌):SCC內(nèi)幾乎均為非典型鱗狀細(xì)胞,SCC團塊中無細(xì)胞間橋,,中心無角化,有絲分裂象多,當(dāng)呈梭形的癌細(xì)胞呈旋渦狀排列時與肉瘤難以鑒別。SCC的標(biāo)準(zhǔn)治療包括手術(shù)、放射治療和化學(xué)藥物治療。然而經(jīng)過上述治療的患者在2年內(nèi)仍然可能復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。鑒于在腫瘤治療過程中基因療法的快速進展和單一基因治療的低穩(wěn)定性和有效性,以及先前研究所表明的攜帶有兩個或者兩個以上基因的重組腺病毒對多發(fā)性骨髓瘤以及喉癌等多個腫瘤具有細(xì)胞毒性,因而需要一個具有高的穩(wěn)定性和有效性的聯(lián)合基因治療方法來進一步改善SCC患者的預(yù)后。在本課題中我們重點研究了與人類重組野生型p53基因相關(guān)的N-myc下游調(diào)節(jié)基因2 (NDRG2)以及鼠雙倍突變體2 (MDM2)的單獨以及聯(lián)合應(yīng)用對SCC的作用。p53是一個著名的抑癌基因,p53信號通路是腫瘤發(fā)生中最常見的突變通路。當(dāng)發(fā)生DNA損傷和各種細(xì)胞毒性時,p53就會誘導(dǎo)受損細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。p53不僅在腫瘤抑制中起著重要作用,它還是一個廣泛的轉(zhuǎn)錄因子。它調(diào)節(jié)著2500多種基因,其中絕大部分的基因都與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲有關(guān)。治療被引進,作為其引起凋亡的結(jié)果,在數(shù)個臨床試驗中表現(xiàn)出了對腫瘤細(xì)胞內(nèi)在的致死性作用,這為控制腫瘤打開了一道新的大門NDRG2為p53基因的靶基因,且可不依賴p53基因單獨起作用。NDRG2屬于NDRG家族的一員。它與ABH超家族具有顯著的結(jié)構(gòu)相似性。它含有兩個亞型。主要的氨基酸序列信息表明:這兩種NDRG2蛋白都顯示了與ABH超家族顯著地結(jié)構(gòu)相似性。NDRG2通過調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞因子在細(xì)胞應(yīng)急反應(yīng)、細(xì)胞分化、增殖、凋亡等許多生物過程中扮演抗增殖、抗侵襲、促凋亡等多重角色。在多種腫瘤細(xì)胞中NDRG2的表達減少或缺失。另外,多種惡性腫瘤的預(yù)后與腫瘤表達NDRG2呈負(fù)相關(guān)。近些年來,許多體內(nèi)和體外研究表明NDRG2在很多腫瘤細(xì)胞中引起細(xì)胞凋亡,具有抗增殖和防擴散作用。NDRG2是P53的一個新的靶基因,參與了細(xì)胞中的DNA損傷反應(yīng),并且在P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用,同時又是一個可以增強腫瘤細(xì)胞化療敏感性的新基因。在本次研究中,我們在體外SCC-13細(xì)胞系以及SCC裸鼠模型中,探索了攜帶siMDM2和NDRG2基因的重組腺病毒對腫瘤體積退化的影響。鼠雙倍突變體2 (MDM2)是一個原癌基因,已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)其突變與擴增,mdm2擴增與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。mdm2基因最初是從一個含有雙微體(murinedoubleminute,MDM)的自發(fā)轉(zhuǎn)化的BALB/3T3DM細(xì)胞中克隆出來的一個高度擴增的基因,此基因位于小鼠的第10號染色體的C1-C3區(qū),1992年Momand等人首次分離和證明了大鼠的mdm2基因產(chǎn)物是一種分子為90000Da的蛋白質(zhì)。野生型p53誘導(dǎo)MDM2的表達,反過來,MDM2通過促進野生型p53的降解以及抑制其轉(zhuǎn)錄活性來形成一個負(fù)反饋環(huán)。MDM2通過負(fù)調(diào)控p53的轉(zhuǎn)錄活性,介導(dǎo)細(xì)胞阻滯和細(xì)胞凋亡,促進腫瘤形成,從而參與了許多人類癌癥的發(fā)生。MDM2的超表達對抗p53基因療法對腫瘤的治療。從而,對p53-MDM2反饋回路進行干擾,就為恢復(fù)p53腫瘤抑制活性,提供了一條新的抗腫瘤策略。MDM2是一種E3泛素連接酶,也是p53通路的重要調(diào)節(jié)者。它以兩種方式負(fù)調(diào)節(jié)p53: 一種是通過直接結(jié)合來抑制轉(zhuǎn)錄;另一種是通過它的E3連接酶活性來降解p53蛋白。ARF直接結(jié)合MDM2然后抑制E3泛素酶的活性來調(diào)節(jié)p53的轉(zhuǎn)錄活性。腫瘤細(xì)胞中,通過腺病毒介導(dǎo)的p53基因治療來提高野生型p53表達的增加,是一種可能的克服p53基因突變的治療方法。Lang等在臨床試驗中發(fā)現(xiàn):瘤內(nèi)注射含p53的腺病毒載體都導(dǎo)致了 p53基因的轉(zhuǎn)錄和功能性外源性p53的表達。因此,通過特定小干擾RNA (siRNA)技術(shù)直接下調(diào)MDM2表達對治療具有P53基因表達的皮膚癌或許是一個有效的方法。目的:研究不同重組腺病毒 Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2基因療法對SCC細(xì)胞系及荷瘤小鼠模型的治療作用,以期為臨床找到更有效的治療SCC的方法。方法:(1)委托漢恒生物科技構(gòu)建重組腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2,利用293A細(xì)胞進行病毒繁殖、純化,得到足夠劑量和濃度的基因治療試驗用病毒。(2)對購買的SCC-13細(xì)胞系進行復(fù)蘇、增殖、傳代等體外培養(yǎng),并進行重組腺病毒 Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2 轉(zhuǎn)染實驗。(3)建立荷瘤小鼠模型,皮下注射0.9%NaCl、重組腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2治療,觀察各組小鼠腫瘤體積大小。(4)利用CCK-8試劑盒檢測重組腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2感染SCC-13細(xì)胞系后SCC-13細(xì)胞的增殖潛力。(5)利用RT-PCR和Western blot從基因和蛋白質(zhì)水平分別研究MDM2、NDRG2基因在重組腺病毒 Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2 感染的SCC-13細(xì)胞系內(nèi)的mRNA表達變化以及相應(yīng)蛋白產(chǎn)物的變化,尤其是從SCC-13細(xì)胞caspase3蛋白表達水平進一步研究重組腺病毒Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2基因治療引起SCC-13細(xì)胞凋亡的機制。(6) Annexin V/PI雙染色法和流式細(xì)胞儀檢測分析評估荷瘤小鼠SCC-13細(xì)胞凋亡率。(7)利用 MTT 研究重組腺病毒 Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2轉(zhuǎn)染SCC-13細(xì)胞后不同時間點SCC-13細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)。結(jié)果:(1)實驗獲得了足夠劑量和濃度的試驗用SCC-13細(xì)胞及重組腺病毒。(2) SCC-13 細(xì)胞能夠被重組腺病毒 Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2高度有效轉(zhuǎn)染,在轉(zhuǎn)染后48h檢測到GFP的表達。且在MOI為100時感染效率最好。(3)皮下注射重組腺病毒 0.9%NaCl、Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2各組小鼠腫瘤體積比較顯示:0.9%NaCl和Ad-GFP組平均腫瘤體積最大,Ad-siMDM2、Ad-NDRG2組平均腫瘤體積相近,Ad-siMDM2-NDRG2組平均腫瘤體積最小。(4)在 Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2 轉(zhuǎn)染的 SCC-13 細(xì)胞內(nèi),與 Ad-GFP 組相比,Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2 組對 SCC-13細(xì)胞增殖具有明顯的抑制。(5)在基因水平的RT-PCR研究結(jié)果顯示:①與對照組相比,重組腺病毒Ad-siMDM2、Ad-siMDM2-NDRG2 轉(zhuǎn)染的 SCC-13 細(xì)胞內(nèi) MDM2 基因的 mRNA 表達顯著減少;②SCC-13細(xì)胞內(nèi)本身NDRG2基因表達水平較低,但在重組腺病毒Ad- NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2轉(zhuǎn)染的SCC-13細(xì)胞內(nèi),NDRG2的超表達相應(yīng)增加了其 mRNA 的表達。重組腺病毒 Ad-GFP、Ad-siMDM2、Ad-NDRG2、Ad-siMDM2-NDRG2基因治療可促進SCC-13 caspase3蛋白表達。在蛋白質(zhì)水平的Western blot研究結(jié)果,驗證了上述基因研究結(jié)果。(6)對荷瘤小鼠瘤細(xì)胞進行的Annexin V/PI雙染色法和流式細(xì)胞儀檢測分析結(jié)果顯示:MDM2基因沉默和NDRG2基因超表達顯著引起小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡。(7) MTT研究SCC-13細(xì)胞毒性效應(yīng)結(jié)果顯示:Ad-siMDM2-NDRG2組與Ad-GFP組相比較,P0.05;同樣 Ad-siMDM2-NDRG2 組與 Ad-siMDM2 組和 Ad-NDRG2 組相比較P0.05。結(jié)論:重組腺病毒Ad-siMDM2-NDRG2聯(lián)合基因治療比單一 Ad-siMDM2或Ad-NDRG2基因治療能更有效的感染SCC,可為SCC的臨床治療提供一個潛在的有效手段。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R739.5

【參考文獻】

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本文編號：1732970