本文選題：鮮紅斑痣　切入點(diǎn)：超微結(jié)構(gòu)　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：目的鮮紅斑痣(Port wine stain,PWS)是一種發(fā)生在人皮膚真皮淺層先天性進(jìn)行性發(fā)展的血管畸形,新生兒的發(fā)生率約為3-5‰,且85%的患者皮損發(fā)生于面部,常持續(xù)終生不退,給患者社會(huì)心理的成長帶來極大的負(fù)面影響,是個(gè)急需解決的重要的臨床問題。許多PWS患者在成年后皮損逐漸增厚并可能發(fā)展為增生結(jié)節(jié)型損害,成為臨床治療的難題,其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)理尚不清楚。本課題將從以下幾個(gè)方面探索增厚結(jié)節(jié)型PWS的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和形成機(jī)理:明確增厚結(jié)節(jié)型PWS不同細(xì)胞成分的超微結(jié)構(gòu)病理特征;研究增厚結(jié)節(jié)型PWS中異常激活的相關(guān)激酶信號通路;篩查PWS結(jié)節(jié)型皮損中特異性的體細(xì)胞突變,為揭示其發(fā)生機(jī)制、探索更為有效的治療方案提供理論依據(jù)。方法1、納入16例PWS患者,收集其不同類型的皮損,6例患者取紅斑型和結(jié)節(jié)型皮損各1份,5例患者僅取結(jié)節(jié)1份,5例患者僅取紅斑組織1份,共收集結(jié)節(jié)紅斑組織各11份;其中另收集7例面部正常皮膚為對照。將組織樣本切割為0.5mm3的組織塊,采用Karnovsky溶液(1%戊二醛和4%多聚甲醛溶于0.1M的磷酸鹽緩沖液中)固定24小時(shí),用1%四氧化鋨后固定,所有樣本逐級脫水、滲透、樹脂包埋,用Leica Ultracut 7切片機(jī)制作厚度約為50 nm的超薄切片并染色,用透射電鏡(Tecnai G2 Spirit,FEI,Hillsboro,Oregon)設(shè)置電壓為80kV進(jìn)行觀察拍照。2、收集來自13例PWS病人的21份組織樣本,包括8份增厚組織,8份結(jié)節(jié)組織以及PWS病人皮損周邊正常組織5份(距離PWS皮損區(qū)約0.5-1 cm),另收集兩例正常人皮膚組織作為對照。皮膚組織樣本在福爾馬林溶液中過夜固定,經(jīng)過脫水清洗后嵌入石蠟中并做成5 mm厚石蠟包塊,組織切片用HE染色,并且用光學(xué)顯微鏡采圖。組織切片行免疫組化檢測,凍存或新鮮組織提取蛋白行Western Blot檢測,研究PKCα、PI3K、PDPK1、PLC-γ、PP2A、DAG等蛋白在PWS紅斑及結(jié)節(jié)組織中的表達(dá)情況。3、收集4例PWS患者的皮膚組織樣本,每例患者均分別獲得紅斑、結(jié)節(jié)及臨近的正常皮膚組織。從新鮮及凍存組織中提取組織DNA,構(gòu)建測序文庫,經(jīng)Agilent2100 bioanalyzer(Agilent DNA 1000 Reagents)確定插入片段大小為100-250bp,使用Agilent SureSelect Human All Exon V5(50M)捕獲平臺(tái)進(jìn)行外顯子組捕獲,洗脫富集的片段后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,測序采用Hiseq 4000測序平臺(tái)行全外顯子測序。采用SAMtools(http://samtools.sourceforge.net/mpileup.shtml)進(jìn)行基因變異檢測分析。結(jié)果1、PWS組織中存在代謝極度活躍的內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、成纖維細(xì)胞,這些細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)都存在大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體、高爾基復(fù)合體、增大的線粒體及大量囊泡。在真皮乳頭和PWS血管周圍可見過度增生肥大的膠原纖維束。在基底層的角質(zhì)形成細(xì)胞中可以見到聚集的黑素小體及近核膜區(qū)粗大的張力纖維�；啄ё儽�、破壞、半橋粒減少,呈現(xiàn)退行性病變特征。2、在PWS組織中檢測PKCα、PI3K、PDPK1、PLC-γ的磷酸化水平及PP2A和DAG的蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)在增厚的紅斑組織較周邊正常組織表達(dá)水平均有所增加;在結(jié)節(jié)組織中這些分子廣泛表達(dá)于血管基質(zhì)中;許多增生的細(xì)胞如成纖維細(xì)胞等,這些分子也表現(xiàn)出明顯的活化及上調(diào);Western Blot結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。上述結(jié)果表明,PKCα、PI3K、PDPK1和PLC-γ的異常激活及PP2A和DAG的上調(diào)不僅僅存在于增厚型PWS組織的內(nèi)皮細(xì)胞中,也可見于結(jié)節(jié)型組織的血管及周圍的成纖維細(xì)胞。3、外顯子測序發(fā)現(xiàn)在PWS增厚和結(jié)節(jié)皮損中存在Trim69(c.825CT/p.T161M)、Muc6(p.Thr1807Ser/c.5420CG)、Muc3a(c.1951AT/p.Ser651Cys;c.1952GC/p.Ser651 Thr;c.1973 CT/p.Ser658 Leu;c.2014TC/p.Phe672Leu)等基因的錯(cuò)義突變。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)僅出現(xiàn)在結(jié)節(jié)樣本中的特異突變有Igfn1(c.5907AG/p.I2008M)錯(cuò)義突變,Mapk7(TC,Chr17:19285524)及Znf528(TC,Chr19:42729848)基因的同義突變。結(jié)論1、在PWS病理進(jìn)行性發(fā)展中存在著代謝與增生活躍的內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、成纖維細(xì)胞,直接導(dǎo)致血管及細(xì)胞外基質(zhì)的增殖,從而導(dǎo)致軟組織增生和結(jié)節(jié)形成。2、PI3K和PKCa信號通路的異常激活在鮮紅斑痣皮損發(fā)展成為增厚及結(jié)節(jié)的過程中可能發(fā)揮重要作用。3、體細(xì)胞基因突變與PWS皮損的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Trim69(c.825CT/p.T161M)、Muc6(p.Thr1807Ser/c.5420CG)、Muc3a(c.1951AT/p.Ser651Cys;c.1952GC/p.Ser651 Thr;c.1973 CT/p.Ser658 Leu;c.2014TC/p.Phe672Leu)等基因突變參與PWS皮損增厚的病理進(jìn)程,而Igfn1(c.5907AG/p.I2008M)等基因突變可能在PWS的結(jié)節(jié)形成中起到重要作用。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R758.51
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本文編號：1722469