本文選題：糖原合成激酶3β（GSK3β）　切入點：細胞自噬　出處：《第四軍醫(yī)大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：皮膚鱗狀細胞癌（Squamous cell carcinoma, SCC）是皮膚科常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年增加，可多發(fā)，常在短期內(nèi)快速生長，易形成潰瘍及轉(zhuǎn)移，嚴重影響患者的健康。目前，皮膚鱗癌確切的發(fā)病機制尚不清楚，治療方法多為手術(shù)切除等對癥處理，與其他惡性腫瘤一樣缺乏根治的方法。因此，尋找新的、有效的治療靶點一直是國內(nèi)外皮膚科學界密切關(guān)注的研究熱點。 糖原合成激酶3β（Glycogen synthase kinase3β, GSK3β）是一種普遍存在于細胞內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，，參與眾多信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)節(jié)，在胚胎發(fā)育、細胞分化、細胞凋亡、干細胞維持和腫瘤形成等方面發(fā)揮重要的作用，被公認為是一種決定細胞命運的關(guān)鍵激酶。紫外線(Ultravioletradiation, UV)尤其是UVB，為誘發(fā)皮膚鱗癌的主要原因之一。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)GSK3β在抑制角質(zhì)形成細胞惡性增殖中起著至關(guān)重要的作用，但是確切的作用機制仍需進一步討論。細胞自噬是機體一種重要的防御和保護機制。細胞通過自噬來降解和清除變性受損、衰老和失去功能的細胞器、蛋白等，在機體的免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應、腫瘤形成等相關(guān)疾病中具有十分重要的作用。大量研究表明UV可提高細胞自噬水平，GSK3β的抑制劑在其它組織中可通過抑制細胞自噬起到保護細胞的作用。那么在皮膚鱗癌的發(fā)病過程中，GSK3β是否可以通過調(diào)節(jié)細胞自噬發(fā)揮作用？其作用機制又是什么？這些都需要進一步研究。本研究擬以皮膚鱗癌、癌前病變?nèi)展庑越腔〖靶∈笊掀ぜ毎鸍B6為主要研究對象，首先利用免疫組織化學技術(shù)和Western blot法檢測GSK3β及其磷酸化水平在皮膚鱗癌和日光性角化病組織中的表達，其次采用建立表達不同GSK3β活性的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，觀察UVB誘導下，GSK3β對細胞生長的影響并探討可能的作用分子機制，為進一步明確皮膚鱗癌的發(fā)病機制及治療提供理論依據(jù)。 研究目的： 以皮膚鱗癌、日光性角化病及正常小鼠上皮細胞JB6為主要研究對象，通過組織、細胞和分子水平實驗： （1）觀察GSK3β與皮膚鱗癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系； （2）觀察GSK3β對UVB作用下細胞生長的影響； （3）探討GSK3β發(fā)揮作用的信號通路，并初步闡明UVB作用下GSK3β調(diào)節(jié)細胞自噬的分子機制。 研究內(nèi)容和方法： 1.采用免疫組織化學技術(shù)及Western blot檢測法觀察GSK3β在皮膚鱗癌及其癌前病變?nèi)展庑越腔〗M織中的表達并進行分析，系統(tǒng)評價GSK3β與皮膚鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系； 2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：脂質(zhì)體法將3種表達不同GSK3β活性的質(zhì)粒：pCDNA3/GSK3β-WT、pCDNA3/GSK3β-S9A、pCDNA3/GSK3β-K85R轉(zhuǎn)染至小鼠上皮細胞JB6細胞株，并篩選、鑒定穩(wěn)定表達不同GSK3β活性的細胞株； 3.細胞增殖檢測：MTT法檢測UVB誘導下，GSK3β對細胞生長的影響； 4. Western blot和GFP-LC3瞬時轉(zhuǎn)染法檢測：UVB誘導下，細胞自噬水平的變化和GSK3β對細胞自噬的影響及其分子機制。 研究結(jié)果： 1. GSK3β蛋白在皮膚鱗癌組織中表達下降，癌前病變更為明顯；p-GSK3βSer9蛋白在病變組織中表達均高于正常組織，且在癌前病變中表達最高；p-GSK3βTyr216蛋白表達無明顯差異； 2.在UVB誘導下，激活GSK3β（GSK3β-WT和GSK3β-S9A轉(zhuǎn)染組）可明顯降低細胞存活和細胞自噬水平；而抑制GSK3β（GSK3β抑制劑氯化鋰處理組和GSK3β-K85R轉(zhuǎn)染組）則可增加細胞存活和細胞自噬水平； 3.抑制細胞自噬可增加UVB誘導的細胞死亡；而促進細胞自噬則減少UVB誘導的細胞死亡； 4. GSK3β抑制劑氯化鋰處理小鼠上皮細胞JB6后，pAMPKThr172蛋白表達呈時間依賴性增強，而PKR、AKT、PERK蛋白表達未見明顯改變； 5. UVB作用下，細胞自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1及GSK3β抑制位點p-GSK3βSer9蛋白表達呈時間依賴性遞增，而GSK3β活化位點p-GSK3βTyr216蛋白表達呈時間依賴性遞減。 結(jié)論：. 1. GSK3β功能在皮膚鱗癌及其癌前病變中是被抑制的，其功能的抑制與皮膚鱗癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)； 2.激活GSK3β可減少UVB誘導的細胞存活，而抑制GSK3β，則增加UVB誘導的細胞存活，提示GSK3β對細胞生長具有負調(diào)控作用； 3.抑制GSK3β可提高pAMPK~(Thr172)蛋白的水平和細胞自噬的表達，提示GSK3β很可能通過抑制LKB1-AMPK-mTOR信號轉(zhuǎn)導通路，調(diào)節(jié)細胞自噬，發(fā)揮生物學作用。
[Abstract]:Cutaneous squamous cell carcinoma (Squamous cell, carcinoma, SCC) is a common malignant tumor in the Department of Dermatology, the incidence rate increased year by year, can be multiple, often in a short period of rapid growth, easy to form ulcer and transfer, seriously affect the health of patients. At present, the exact pathogenesis of cutaneous squamous cell carcinoma is unclear. The treatment methods for surgery excision of symptomatic treatment, lack of cure method with other malignant tumors. Therefore, searching for new and effective therapeutic targets has been a hot research at home and abroad pay close attention to the skin in the scientific community.
Glycogen synthase kinase 3 beta (Glycogen beta synthase kinase3, GSK3) is a ubiquitous intracellular serine / threonine protein kinase involved in the regulation of many signal transduction pathways, in embryonic development, cell differentiation, apoptosis, play an important role in stem cell maintenance and tumor formation, is recognized as a key kinase that determine cell fate. Ultraviolet (Ultravioletradiation, UV) UVB especially, as one of the main causes of skin squamous cell carcinoma. Previous study found that GSK3 beta plays a crucial role in inhibiting cell proliferation and malignant keratinocytes, but the exact mechanism still need further discussion. Autophagy is a body an important defense and protection mechanisms. Cells through autophagy to degradation and removal of damaged organelles, degeneration, aging and loss of function protein, in immune regulation, inflammation 鍙嶅簲,鑲跨槫褰㈡垚絳夌浉鍏崇柧鐥呬腑鍏鋒湁鍗佸垎閲嶈鐨勪綔鐢

本文編號：1646587