本文選題：puma　切入點：凋亡　出處：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的探討皮膚鱗狀細胞癌是否存在puma基因DNA序列、mRNA水平、蛋白質(zhì)表達改變。 方法優(yōu)化并最終確立了puma基因3個高GC含量外顯子的擴增條件；采用實時熒光定量PCR的方法檢測puma mRNA水平；進行Western blot險測PUMA蛋白的表達。 1.通過對實驗條件的摸索,確立了puma基因3個外顯子最終的擴增條件,分別如下： (1)Exon2的反應(yīng)體系為2×Mastermix30μl上下游引物(10μmol/L)各1.5μl,模板DNA3.0μl,ddH2O24μl,總體積60μl；反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min,95℃45s、68℃45s、72℃45s,循環(huán)33次,最后72℃延伸5min。 (2) Exon3的反應(yīng)體系各組分和Exon2相同；反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min,95℃45s、63℃45s、72℃45s,循環(huán)33次,最后72℃延伸5min。 (3) Exon4的反應(yīng)體系各組分和Exon2相同；反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min,95℃45s、55℃45s、72℃45s,循環(huán)33次,最后72℃延伸5min。 2.通過對實驗條件的摸索,建立實時熒光定量PCR檢測puma mRNA的方法。實時熒光定量法檢測puma mRNA的反應(yīng)體系：2×SYBR premix10μl,上下游引物(10μmol/L)各0.4μl,ROX0.4μl,cDNA1.0gl,滅菌水7.8μl,總體系20μl。擴增條件：95℃預(yù)變性5min,95℃變性10s,60℃退火5s,72℃延伸10s,5個循環(huán)(不測熒光),95℃變性10s,60℃退火5s,72℃延伸10s,89℃延伸27s,40個循環(huán)(測熒光),終末65℃延伸5min。內(nèi)參GAPDH擴增體系同上,擴增條件：95℃預(yù)變性5min,95℃變性15s,64℃退火5s,72℃延伸10s,5個循環(huán)(不測熒光),95℃變性15s,64℃退火5s,72℃延伸10s,78℃3s,72℃延伸30s,40個循環(huán)(測熒光),終末65℃延伸5min。(注：應(yīng)用于繪制標準曲線的質(zhì)粒為本課題前期試驗細菌保種的TA克隆方法構(gòu)建的pMD18-T(+)/puma和pMD18-T(+)/GAPDH重組質(zhì)粒) 3.用Western Blot的方法檢測PUMA蛋白的表達,采用B-actin作為內(nèi)參基因。 結(jié)果 1.應(yīng)用優(yōu)化的擴增體系和條件對32例皮膚鱗狀細胞癌組織的puma基因Exon2^3、4進行了PCR擴增,擴增產(chǎn)物測序后經(jīng)Blast2序列比對分析,未發(fā)現(xiàn)任何突變。 2.采用實時熒光定量方法檢測puma mRNA水平,puma mRNA在鱗癌組織和正常對照組中均有表達,但puma mRNA水平在皮膚鱗癌組織和正常皮膚對照組織的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 3.用Western Blot的方法檢測PUMA蛋白的表達,采用?-actin作為內(nèi)參基因,32例皮膚鱗癌組織和2例正常皮膚對照的內(nèi)參基因均表達,但只有8例皮膚鱗癌組織和1例正常對照表達PUMA,且表達量都相對較低。 結(jié)論 1. puma基因Exon2、3、4的編碼序列保守且穩(wěn)定。 2. puma mRNA的相對水平在皮膚磷癌組織和正常組織中的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。 3. PUMA蛋白在皮膚組織的表達相對較低。
[Abstract]:Objective to investigate the expression of puma DNA sequence and protein in cutaneous squamous cell carcinoma (SCC). Methods the amplification conditions of three exons with high GC content of puma gene were optimized and finally established, the puma mRNA level was detected by real-time fluorescence quantitative PCR, and the expression of PUMA protein was detected by Western blot. 1. By exploring the experimental conditions, the final amplification conditions of three exons of puma gene were established, which were as follows:. The reaction system was 2 脳 Mastermix30 渭 l primer 10 渭 mol / L, template DNA3.0 渭 lddH _ 2O 24 渭 l, total volume 60 渭 l.The reaction conditions were: predenaturation at 95 鈩，

本文編號：1638183