發(fā)布時(shí)間：2018-03-08 20:34

  本文選題：受體　切入點(diǎn)：Tie2　出處：《福建醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:構(gòu)建和鑒定攜帶Tie2-SiRNA基因的慢病毒載體,利用Tie2-SiRNA慢病毒載體介導(dǎo)RNA干擾作用來(lái)沉默Tie2基因在惡性黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá),體外研究其對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞中Tie2基因的抑制效率,為將來(lái)進(jìn)一步進(jìn)行裸鼠惡性黑色素瘤移植瘤生長(zhǎng)的體內(nèi)抑制實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ),為腫瘤的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 1、首先利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ將pSilencer1.0-U6-Tie2-siRNA重組質(zhì)粒酶切成所需的目的片段U6-Tie2-siRNA,電泳鑒定。 2、利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切空載質(zhì)粒pNL-EGFP,電泳鑒定。 3、將經(jīng)XbaⅠ酶酶切電泳鑒定的空載質(zhì)粒與電泳鑒定正確的目的片段U6-Tie2-siRNA以1:10濃度進(jìn)行連接反應(yīng),構(gòu)建pEGFP-Tie2-Ⅰ、pEGFP-Tie2-Ⅱ慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒,電泳挑選陽(yáng)性單克隆,測(cè)序鑒定。 4、將連接成功的pEGFP-Tie2-Ⅰ、pEGFP-Tie2-Ⅱ慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒,分別與包膜質(zhì)粒pVSVG和包裝質(zhì)粒pHelper一起組成慢病毒三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng),按摩爾濃度1:1:1的條件共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,生產(chǎn)pEGFP-Tie2-Ⅰ、pEGFP-Tie2-Ⅱ慢病毒。 5、將收集到的病毒上清液按不同的濃度感染293T細(xì)胞,測(cè)定所收集的病毒原液的滴度。 6、將收集的病毒原液按不同的感染復(fù)數(shù)感染感染惡性黑色素瘤細(xì)胞,確定合適的感染復(fù)數(shù)。 7、在合適的感染復(fù)數(shù)條件下,將收集到的慢病毒原液感染惡性黑色素瘤細(xì)胞,通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)惡性黑色素瘤細(xì)胞中Tie2基因的表達(dá)量,進(jìn)而得到RNA干擾沉默Tie2基因表達(dá)的效率。 結(jié)果: 1、成功利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ從重組質(zhì)粒pSilencer 1.0-U6-Tie2-siRNA中酶切出所需要的目的片段U6-Tie2-siRNA。 2、成功構(gòu)建慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEGFP-Tie2-Ⅰ、pEGFP-Tie2-Ⅱ,利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切電泳及測(cè)序鑒定,結(jié)果正確。 3、成功使用三質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)構(gòu)建了Tie2-SiRNA慢病毒載體,293T細(xì)胞測(cè)定病毒原液滴度為8.8×10~3/ml。 4、感染復(fù)數(shù)為80條件下,慢病毒感染惡性黑色素瘤細(xì)胞的效率為94.5%,實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果:Tie2-SiRNA慢病毒載體抑制了惡性黑色素瘤細(xì)胞中Tie2基因的表達(dá),其中較高者可達(dá)到68.55%(P0.05),同時(shí)兩種慢病毒載體之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P0.05)。 結(jié)論:成功使用三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)構(gòu)建了Tie2-SiRNA慢病毒載體,同時(shí)其能以較高的感染效率在體外感染惡性黑色素瘤細(xì)胞,且能抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞的Tie2基因的表達(dá),為下一步進(jìn)行裸鼠惡性黑色素瘤移植瘤生長(zhǎng)的體內(nèi)抑制實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ),提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:Aim: to construct and identify the lentivirus vector carrying Tie2-SiRNA gene, and to silence the expression of Tie2 gene in malignant melanoma cells by RNA interference mediated by Tie2-SiRNA lentivirus vector. In vitro, the inhibition efficiency of Tie2 gene in malignant melanoma cells was studied in order to lay a foundation for further in vivo inhibition of the growth of malignant melanoma in nude mice and to provide experimental basis for gene therapy of malignant melanoma. Methods:. 1. Firstly, the recombinant plasmid of pSilencer1.0-U6-Tie2-siRNA was digested with restriction endonuclease Xba 鈪，

本文編號(hào)：1585444