本文選題：惡性黑色素瘤　切入點：PPO　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:惡性黑色素瘤是全世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,惡性程度高,發(fā)病率逐漸上升,嚴重威脅人們的健康。已有研究表明,惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個由多種癌基因、抑癌基因共同參與的多階段過程。癌基因PPO在多種腫瘤組織中存在過表達。c-Myc、c-Fos基因為核內(nèi)癌基因,參與細胞增殖和凋亡的調(diào)控,在惡性黑色素瘤中存在過表達。PPO基因位于細胞質(zhì)內(nèi),是MAPK通路中一個新的癌基因,而c-Myc、c-Fos基因也都是MAPK通路中的癌基因。鑒于惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展與MAPK通路有密切關(guān)系,PPO在惡性黑色素瘤中的表達情況,與c-Myc、c-Fos的關(guān)系以及在MAPK通路中的位置都很值得研究。探討惡性黑色素瘤的發(fā)病機制,對降低惡性黑色素瘤的發(fā)病率和死亡率,有著十分重要的意義。 惡性黑色素瘤常規(guī)化療不佳,基因靶向治療成為了新的方向。RNA干擾是雙鏈RNA分子在mRNA水平上關(guān)閉相關(guān)基因表達的過程,人們開始將其用在藥物靶向治療惡性黑色素瘤等研究上。RNA干擾癌基因PPO能否發(fā)揮體內(nèi)外抑制惡性黑色素瘤細胞的作用,是否具有臨床應(yīng)用價值值得期待。 中藥輔助治療也很有現(xiàn)實意義。三氧化二砷是砒霜的主要成分,可通過抑制NF-κB P65和C-IAP2基因的表達誘導(dǎo)人黑色素瘤A375細胞凋亡。三氧化二砷誘導(dǎo)A375細胞凋亡是否還存在其它傳導(dǎo)通路,在體內(nèi)是否同樣有效,是否通過下調(diào)PPO基因而發(fā)揮抑制作用值得進一步研究。 為此,本研究涉及癌基因PPO在惡性黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用,PPO在MAPK通路中的位置,PPO基因靶向治療和中藥治療4個方面,從組織水平、細胞水平、分子水平3個層面,從發(fā)病到治療進行一系列初步研究。擬探討PPO、c-Myc及c-Fos蛋白在惡性黑色素瘤組織中的表達情況及其意義;應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默PPO,觀察對人惡性黑色素瘤細胞A375的增殖抑制,觀察其對荷瘤裸鼠體內(nèi)黑色素瘤的生長抑制,并探討其可能的作用機制;觀察A_(S2)O_3對人惡性黑色素瘤細胞A375增殖和凋亡的影響,檢測干預(yù)前后PPO蛋白表達的變化,觀察A_(S2)O_3對荷瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤生長的抑制,探討下調(diào)PPO的表達是否是A_(S2)O_3治療惡性黑色素瘤的作用機制之一。以期揭示癌基因PPO與惡性黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機制,為PPO成為惡性黑色素瘤臨床診斷參考指標和基因靶向治療惡性黑色素瘤的新靶點等方面提供理論依據(jù)。 方法: 1 PPO、c-Myc及c-Fos蛋白在惡性黑色素瘤組織的表達及意義 免疫組織化學(xué)方法及流式細胞術(shù)檢測惡性黑色素瘤、色素痣組織中PPO、c-Myc及c-Fos蛋白的表達。 2研究RNAi沉默PPO基因?qū)θ藧盒院谏亓黾毎闍375增殖和凋亡的影響 PPO腺病毒載體和空轉(zhuǎn)錄病毒載體均為攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP),轉(zhuǎn)入細胞后有綠色熒光表達。將它們轉(zhuǎn)染入人惡性黑色素瘤A375細胞;熒光顯微鏡下觀察不同MOI(病毒個數(shù)/細胞個數(shù))=5,10,20,50,100時,腺病毒轉(zhuǎn)染A375細胞的效率及細胞分化、形態(tài)變化。取轉(zhuǎn)染48h后細胞做RT-PCR,觀察A375細胞PPO的表達變化。MTT比色分析法檢測MOI=50時,在轉(zhuǎn)染后第1天、第3天、第5天、第7天對A375細胞增殖抑制的影響。采用流式細胞分析術(shù),Anexin-V-PI雙染色檢測MOI=50時,在轉(zhuǎn)染后第1天、第3天、第5天、第7天A375細胞早期凋亡的變化。 3研究RNAi沉默PPO基因?qū)闪雎闶蠛谏亓錾L的抑制作用 建立人惡性黑色素瘤A375裸鼠荷瘤模型,用PPO腺病毒載體作用于荷瘤裸鼠,觀測瘤體大小和瘤體重量,計算抑制率,取出腫瘤進行HE染色。 4研究A_(S2)O_3對人惡性黑色素瘤細胞株A375增殖和凋亡的影響,探討其分子機制。 常規(guī)培養(yǎng)人惡性黑色素瘤細胞株A375。采用MTT法檢測不同濃度的A_(S2)O_3(1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)在24h、48h及72h三個時間點對人A375細胞的增殖抑制作用;流式細胞術(shù)分析A_(S2)O_3對細胞周期及凋亡的影響,倒置相差顯微鏡觀察藥物處理后對人A375細胞的細胞分化及形態(tài)的影響,免疫細胞化學(xué)s-p法和熒光免疫細胞化學(xué)方法檢測A_(S2)O_3對PPO蛋白表達的影響。 5研究A_(S2)O_3對荷瘤裸鼠黑色素瘤生長的抑制作用 建立人惡性黑色素瘤A375裸鼠荷瘤模型,用A_(S2)O_3作用于荷瘤裸鼠,觀測瘤體大小和瘤體重量,計算抑制率,取出腫瘤進行HE染色。 結(jié)果: 1 PPO、c-Myc及c-Fos在惡性黑色素瘤中的表達 PPO蛋白陽性產(chǎn)物定位于細胞漿,呈棕黃色顆粒狀,彌漫或散在分布;c-Myc及c-Fos蛋白陽性產(chǎn)物均定位于細胞核,呈棕黃色顆粒狀,彌漫或散在分布。惡性黑色素瘤組織中PPO、c-Myc及c-Fos的表達與色素痣組織中PPO、c-Myc及c-Fos表達分別相比較,差異具有顯著性(P 0.05)。 2 RNAi沉默PPO基因?qū)盒院谏亓黾毎闍375增殖和凋亡的影響 轉(zhuǎn)染24h后MOI=5,10,20,50,100時轉(zhuǎn)染效率分別為55±3.5%、63.7±2.3%,72.3±2.5%、71.5±2.1%、75.6±1.6%。MOI=50時轉(zhuǎn)染效率達到最大且增大MOI值轉(zhuǎn)染效率不再變化,故以下轉(zhuǎn)染實驗取MOI=50時轉(zhuǎn)染后不同時間對細胞的影響。A375出現(xiàn)不同程度的皺縮、破裂,細胞生長狀態(tài)不佳,有的細胞變狹長兩端出現(xiàn)偽足,漂浮細胞增多,隨時間延長,上述現(xiàn)象更加明顯。轉(zhuǎn)染A375細胞48h后,用RT-PCR方法檢測PPO基因mRNA表達,實驗組較陰性對照組,空轉(zhuǎn)錄病毒組的mRNA表達強度減低,證明腺病毒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染A375細胞并部分沉默PPO基因。MTT比色分析法發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后第5天實驗組與陰性對照組,實驗組與空轉(zhuǎn)錄病毒組均有顯著性差異(P0.05)。流式細胞儀,Anexin-V-PI雙染色檢測MOI=50轉(zhuǎn)染后不同時間A375細胞早期凋亡率的變化,與對照組相比,有顯著性差異(P 0.05)。 3 RNAi沉默PPO基因?qū)闪雎闶蠛谏亓錾L的抑制作用 裸鼠皮下腫瘤細胞接種后,活動能力、飲食情況良好,在接種部位先后出現(xiàn)點狀或點線狀黑色素瘤體。每3天觀察腫瘤生長情況,于第7天開始分組進行實驗,根據(jù)每3天記錄的腫瘤體積變化,繪制腫瘤生長曲線圖,可以看出陰性對照組與空病毒轉(zhuǎn)染組的腫瘤生長速度顯著高于PPO轉(zhuǎn)染組(P0.05),兩對照組組間則沒有差別(P0.05)。第21天,處死裸鼠,剝離腫瘤,測量大小并稱重。裸鼠的平均瘤重PPO轉(zhuǎn)染組低于空轉(zhuǎn)錄病毒和陰性對照組,有顯著性差異(P0.05),空轉(zhuǎn)錄病毒和陰性對照組比較無顯著性差異(P0.05)。PPO轉(zhuǎn)染組抑瘤率為49.6%。將腫瘤瘤塊進行HE染色研究,我們發(fā)現(xiàn)PPO轉(zhuǎn)染組的腫瘤出現(xiàn)細胞壞死以及核固縮等凋亡現(xiàn)象,空轉(zhuǎn)錄病毒和陰性對照組無明顯凋亡現(xiàn)象。 4 A_(S2)O_3對人惡性黑色素瘤細胞株A375增殖和凋亡的影響及調(diào)控PPO蛋白的表達 MTT法證實A_(S2)O_3在1μmol/L至10μmol/L濃度范圍內(nèi)對A375細胞有明顯的增殖抑制作用,呈現(xiàn)明顯的劑量和時間依賴效應(yīng)關(guān)系。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),隨著藥物濃度的增加,G0/G1的細胞逐漸減少(P0.05),S期的比例顯著增加,出現(xiàn)S期阻滯。倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞出現(xiàn)典型凋亡細胞形態(tài)學(xué)改變。免疫細胞化學(xué)法檢測PPO蛋白主要表達于A375細胞胞漿內(nèi),染色呈棕黃色。A_(S2)O_3作用48h后,隨著藥物濃度的增加,PPO蛋白的染色程度逐漸減弱,差異具有顯著性(P0.05)。 5 A_(S2)O_3對荷瘤裸鼠黑色素瘤生長的抑制作用 裸鼠皮下腫瘤細胞接種后,活動能力、飲食情況良好,在接種部位先后出現(xiàn)點狀或點線狀黑色素瘤體。每3天觀察腫瘤生長情況,于第7天開始分組進行實驗,根據(jù)每3天記錄的腫瘤體積變化繪制腫瘤生長曲線圖,可以看出A_(S2)O_3組與順鉑組的腫瘤生長速度顯著低于陰性對照組(P 0.05),順鉑組較A_(S2)O_3組更低(P0.05)。第21天,處死裸鼠,剝離腫瘤,測量大小并稱重。A_(S2)O_3組裸鼠的平均瘤重低于陰性對照組,但高于順鉑組,均有顯著性差異(P0.05)。不同劑量A_(S2)O_3組的抑瘤率分別為52.6%、78.1%、86.2%。將腫瘤瘤塊進行HE染色研究,我們發(fā)現(xiàn)A_(S2)O_3治療組與順鉑組的腫瘤出現(xiàn)細胞壞死以及核固縮等凋亡現(xiàn)象,陰性對照組無明顯凋亡現(xiàn)象。 結(jié)論: 1聯(lián)合檢測PPO、c-Myc及c-Fos蛋白在惡性黑色素瘤組織中的表達,證實了PPO、c-Myc及c-Fos在惡性黑色素瘤組織中的異常高表達,提示癌基因PPO、c-Myc、c-Fos在惡性黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用。 2 RNA干擾PPO經(jīng)腺病毒載體成功轉(zhuǎn)染人惡性黑色素瘤A375細胞。RNA干擾PPO能下調(diào)人A375惡性黑色素瘤細胞PPO基因的表達,對A375細胞有增殖抑制作用,并能誘導(dǎo)A375細胞早期凋亡。 3 RNA干擾PPO在體內(nèi)可以抑制惡性黑色素瘤荷瘤裸鼠的腫瘤生長。PPO有望成為惡性黑色素瘤治療中重要的靶點。 4 A_(S2)O_3可抑制人惡性黑色素瘤A375細胞的增殖,并誘導(dǎo)凋亡發(fā)生,且與A_(S2)O_3的濃度和作用時間成正相關(guān)。證實下調(diào)癌基因PPO的表達可能是A_(S2)O_3抑制A375細胞增殖的機制之一。 5 A_(S2)O_3體內(nèi)可以同樣抑制腫瘤生長,但療效不及順鉑,A_(S2)O_3可以作為惡性黑色素瘤輔助治療藥物,具有一定應(yīng)用價值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R739.5

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本文編號：1577992