本文選題：miRNA　切入點(diǎn)：UVB　出處：《中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：人體膚色受多種因素影響,紫外線(ultraviolet,UV)照射為重要影響因素之一,其中,中波紫外線(ultravioletB, UVB)能使黑素細(xì)胞數(shù)目增多,細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活化,合成黑素小體功能增強(qiáng),并促進(jìn)黑素小體由黑素細(xì)胞向周圍角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。與UVB相關(guān)的色素沉著性皮膚病是皮膚科臨床工作中的常見(jiàn)病,共同的臨床特點(diǎn)是面頸部等曝光部位為主的色素沉著斑片或斑點(diǎn),治療棘手,病情遷延,嚴(yán)重影響患者的正常社交及生活質(zhì)量。既往研究發(fā)現(xiàn)小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia-associated transcription factor, MITF)是調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞色素合成的關(guān)鍵分子,可靶向調(diào)節(jié)二十余個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄活性,包括調(diào)控黑素生成的基因、黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)基因、介導(dǎo)體內(nèi)生理性黑素合成的神經(jīng)內(nèi)分泌信號(hào)的受體、黑素小體的結(jié)構(gòu)蛋白等。近年來(lái),microRNA (miRNA),因其能夠?qū)δ康幕蜻M(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控,影響細(xì)胞的多種生物學(xué)功能成為腫瘤及炎癥性疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),它是一類長(zhǎng)度約為22～25nt大小的單鏈非編碼小分子RNA,可與靶向調(diào)控的信使RNA (messenger RNA, mRNA)相結(jié)合,促進(jìn)其降解或抑制其蛋白翻譯。課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)UVB照射可引起永生化人表皮黑素細(xì)胞(Pig-1)miRNA表達(dá)譜發(fā)生變化,其中miRNA-340的表達(dá)變化具有時(shí)相性,即在UVB照射后3h表達(dá)增高,靶向結(jié)合黑素細(xì)胞樹(shù)突生長(zhǎng)的抑制因子RhoA,從而促進(jìn)樹(shù)突生長(zhǎng)影響黑素代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),miRNA-340在UVB照射后24h表達(dá)下降,通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)并查閱文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)MITF可能是miRNA-340的靶分子,由此我們推測(cè)人黑素細(xì)胞經(jīng)UVB刺激后,miRNA-340可能靶向結(jié)合MITF分子的mRNA,誘導(dǎo)其降解并抑制其轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程,從而影響MITF相關(guān)信號(hào)通路的下游分子,如酪氨酸酶(Tyrosinase, TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1 (Tyrosinase related protein -1, TYRP-1)等,抑制黑素合成,成為治療臨床UVB相關(guān)色素沉著性皮膚病的新靶點(diǎn)。第一部分:UVB照射后miRNA-340變化趨勢(shì)與黑素合成的相關(guān)性研究目的:通過(guò)研究UVB誘導(dǎo)后Pig-1細(xì)胞miRNA-340與色素合成相關(guān)分子MITF、TYR、TYRP-1的變化趨勢(shì)關(guān)系,并對(duì)UVB處理后的Pig-1細(xì)胞進(jìn)行色素測(cè)定,初步明確miRNA-340可能通過(guò)調(diào)節(jié)MITF參與UVB誘導(dǎo)的色素合成過(guò)程。方法:使用100mJ/cm2UVB處理Pig-1細(xì)胞,利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time quantitative PCR,qRT-PCR)檢測(cè)照射后0h、3h、6h、12h、16h、24h的實(shí)驗(yàn)組Pig-1細(xì)胞與未照射組的Pig-1細(xì)胞中miRNA-340的趨勢(shì)差異表達(dá),以及相同條件處理后Pig-1細(xì)胞中色素合成相關(guān)分子MITF、TYR、TYRP-1的mRNA變化趨勢(shì);應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測(cè)UVB照射后黑素合成相關(guān)分子MITF、TYR、TYRP1蛋白水平變化;使用氫氧化鈉溶解法檢測(cè)UVB照射后黑素含量變化趨勢(shì)。結(jié)果:miRNA-340水平在照射后3h開(kāi)始上升,6h達(dá)高峰,12h至24h持續(xù)下降。MITF水平在照射后3h上升,6h顯著下降,于12h明顯上升至16h達(dá)到頂峰,24h明顯下降。TYR水平除24h組外,其余各組與對(duì)照組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TYRP-1照射后3h開(kāi)始上升,16h達(dá)高峰,24h下降。MITF在蛋白水平于照射后16h表達(dá)最高。TYR各時(shí)間點(diǎn)蛋白表達(dá)量變化不顯著。TYRP-1在照射后6h無(wú)顯著變化,16h表達(dá)增高,24h表達(dá)水平明顯下降。色素測(cè)定結(jié)果提示照射后6h色素含量開(kāi)始持續(xù)上升,至24h時(shí)色素含量較未照射組增加1.4倍。結(jié)論:在人黑素細(xì)胞中,miRNA-340可能與MITF靶向結(jié)合并引起MITF的降解并抑制其表達(dá),可能通過(guò)TYRP-1介導(dǎo)對(duì)UVB照射后黑素細(xì)胞的色素產(chǎn)生過(guò)程發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。第二部分:miRNA-340調(diào)節(jié)MITF分子誘導(dǎo)UVB照射后黑素合成的作用機(jī)制研究目的:通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證miRNA-340與MITF的靶向結(jié)合關(guān)系,使用miRNA-340擬似物和抑制物感染Pig-1細(xì)胞后確認(rèn)其對(duì)MITF在UVB照射后的調(diào)節(jié)作用,從而進(jìn)一步明確miRNA-340通過(guò)調(diào)節(jié)MITF引起UVB誘導(dǎo)色素合成的科學(xué)推論,為臨床治療UVB相關(guān)色素沉著性疾病提供新思路與新靶點(diǎn)。方法:使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)(dual-luciferasereporterassay)驗(yàn)證miRNA-340與MITF的靶向結(jié)合關(guān)系。使用含miRNA-340擬似物(miRNA-340 mimic)和抑制物(miRNA-340inhibitor)的慢病毒感染Pig-1細(xì)胞,制備miRNA-340過(guò)表達(dá)及低表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。使用qRT-PCR方法驗(yàn)證UVB照射后miRNA-340穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中與色素合成相關(guān)分子MITF、TYR、TYRP-1的趨勢(shì)關(guān)系。使用蛋白免疫印跡法檢測(cè)UVB照射后miRNA-340穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株與黑素合成相關(guān)分子MITF、TYR、TYRP-1蛋白表達(dá)變化。使用氫氧化鈉溶解法檢測(cè)UVB照射后miRNA-340過(guò)表達(dá)及低表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株不同時(shí)相黑素含量變化。結(jié)果:使用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染野生型MITF的3'UTR質(zhì)粒和miRNA-340質(zhì)粒后,熒光素酶表達(dá)活性較陰性對(duì)照組下降(約12%),兩者比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用qRT-PCR分別檢測(cè)miRNA-340擬似物(miRNA-340 mimic)、miRNA-340 抑制物(miRNA-340inhibitor)慢病毒感染 Pig-1 細(xì)胞內(nèi)的miRNA-340水平,證明miRNA-340過(guò)表達(dá)與低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功。UVB照射Pig-1細(xì)胞(NC)及miRNA-340inhibitor低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞,照射后16h發(fā)現(xiàn)MITF、TYR、TYRP-1表達(dá)量均上調(diào)。UVB照射Pig-1細(xì)胞(NC)、過(guò)表達(dá)及低表達(dá)miRNA-340的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞后24h測(cè)定色素發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miRNA-340穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組UVB照射后24h色素含量與NC組比顯著降低,低表達(dá)組與NC組比色素含量顯著增高。結(jié)論:miRNA-340靶向結(jié)合MITF的3'UTR特異性堿基抑制MITF表達(dá)并誘導(dǎo)其mRNA降解,同時(shí)可抑制色素合成通路的多個(gè)關(guān)鍵分子表達(dá),下調(diào)UVB照射后黑素細(xì)胞產(chǎn)生色素的總量。綜上提示miRNA-340可能成為臨床治療UVB相關(guān)色素沉著性疾病以及制備美白制劑的新靶點(diǎn)。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R751

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李蕓;劉潔;孫秋寧;;黃褐斑的皮膚鏡學(xué)特征[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);2015年02期

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本文編號(hào)：1566495