本文選題：miRNA　切入點：UVB　出處：《中國人民解放軍醫(yī)學院》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：人體膚色受多種因素影響,紫外線(ultraviolet,UV)照射為重要影響因素之一,其中,中波紫外線(ultravioletB, UVB)能使黑素細胞數(shù)目增多,細胞內酪氨酸酶活化,合成黑素小體功能增強,并促進黑素小體由黑素細胞向周圍角質形成細胞轉運。與UVB相關的色素沉著性皮膚病是皮膚科臨床工作中的常見病,共同的臨床特點是面頸部等曝光部位為主的色素沉著斑片或斑點,治療棘手,病情遷延,嚴重影響患者的正常社交及生活質量。既往研究發(fā)現(xiàn)小眼畸形相關轉錄因子(microphthalmia-associated transcription factor, MITF)是調節(jié)黑素細胞色素合成的關鍵分子,可靶向調節(jié)二十余個基因的轉錄活性,包括調控黑素生成的基因、黑素小體轉運基因、介導體內生理性黑素合成的神經內分泌信號的受體、黑素小體的結構蛋白等。近年來,microRNA (miRNA),因其能夠對目的基因進行轉錄后水平的調控,影響細胞的多種生物學功能成為腫瘤及炎癥性疾病研究領域的熱點,它是一類長度約為22～25nt大小的單鏈非編碼小分子RNA,可與靶向調控的信使RNA (messenger RNA, mRNA)相結合,促進其降解或抑制其蛋白翻譯。課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)UVB照射可引起永生化人表皮黑素細胞(Pig-1)miRNA表達譜發(fā)生變化,其中miRNA-340的表達變化具有時相性,即在UVB照射后3h表達增高,靶向結合黑素細胞樹突生長的抑制因子RhoA,從而促進樹突生長影響黑素代謝和轉運。同時發(fā)現(xiàn),miRNA-340在UVB照射后24h表達下降,通過生物信息學軟件預測并查閱文獻,發(fā)現(xiàn)MITF可能是miRNA-340的靶分子,由此我們推測人黑素細胞經UVB刺激后,miRNA-340可能靶向結合MITF分子的mRNA,誘導其降解并抑制其轉錄翻譯過程,從而影響MITF相關信號通路的下游分子,如酪氨酸酶(Tyrosinase, TYR)、酪氨酸酶相關蛋白-1 (Tyrosinase related protein -1, TYRP-1)等,抑制黑素合成,成為治療臨床UVB相關色素沉著性皮膚病的新靶點。第一部分:UVB照射后miRNA-340變化趨勢與黑素合成的相關性研究目的:通過研究UVB誘導后Pig-1細胞miRNA-340與色素合成相關分子MITF、TYR、TYRP-1的變化趨勢關系,并對UVB處理后的Pig-1細胞進行色素測定,初步明確miRNA-340可能通過調節(jié)MITF參與UVB誘導的色素合成過程。方法:使用100mJ/cm2UVB處理Pig-1細胞,利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time quantitative PCR,qRT-PCR)檢測照射后0h、3h、6h、12h、16h、24h的實驗組Pig-1細胞與未照射組的Pig-1細胞中miRNA-340的趨勢差異表達,以及相同條件處理后Pig-1細胞中色素合成相關分子MITF、TYR、TYRP-1的mRNA變化趨勢;應用蛋白免疫印跡法檢測UVB照射后黑素合成相關分子MITF、TYR、TYRP1蛋白水平變化;使用氫氧化鈉溶解法檢測UVB照射后黑素含量變化趨勢。結果:miRNA-340水平在照射后3h開始上升,6h達高峰,12h至24h持續(xù)下降。MITF水平在照射后3h上升,6h顯著下降,于12h明顯上升至16h達到頂峰,24h明顯下降。TYR水平除24h組外,其余各組與對照組差異不具有統(tǒng)計學意義。TYRP-1照射后3h開始上升,16h達高峰,24h下降。MITF在蛋白水平于照射后16h表達最高。TYR各時間點蛋白表達量變化不顯著。TYRP-1在照射后6h無顯著變化,16h表達增高,24h表達水平明顯下降。色素測定結果提示照射后6h色素含量開始持續(xù)上升,至24h時色素含量較未照射組增加1.4倍。結論:在人黑素細胞中,miRNA-340可能與MITF靶向結合并引起MITF的降解并抑制其表達,可能通過TYRP-1介導對UVB照射后黑素細胞的色素產生過程發(fā)揮調節(jié)作用。第二部分:miRNA-340調節(jié)MITF分子誘導UVB照射后黑素合成的作用機制研究目的:通過雙熒光素酶報告基因檢測驗證miRNA-340與MITF的靶向結合關系,使用miRNA-340擬似物和抑制物感染Pig-1細胞后確認其對MITF在UVB照射后的調節(jié)作用,從而進一步明確miRNA-340通過調節(jié)MITF引起UVB誘導色素合成的科學推論,為臨床治療UVB相關色素沉著性疾病提供新思路與新靶點。方法:使用雙熒光素酶報告基因檢測(dual-luciferasereporterassay)驗證miRNA-340與MITF的靶向結合關系。使用含miRNA-340擬似物(miRNA-340 mimic)和抑制物(miRNA-340inhibitor)的慢病毒感染Pig-1細胞,制備miRNA-340過表達及低表達的穩(wěn)轉細胞株。使用qRT-PCR方法驗證UVB照射后miRNA-340穩(wěn)轉細胞株中與色素合成相關分子MITF、TYR、TYRP-1的趨勢關系。使用蛋白免疫印跡法檢測UVB照射后miRNA-340穩(wěn)轉細胞株與黑素合成相關分子MITF、TYR、TYRP-1蛋白表達變化。使用氫氧化鈉溶解法檢測UVB照射后miRNA-340過表達及低表達的穩(wěn)轉細胞株不同時相黑素含量變化。結果:使用熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)共轉染野生型MITF的3'UTR質粒和miRNA-340質粒后,熒光素酶表達活性較陰性對照組下降(約12%),兩者比較,差異具有統(tǒng)計學意義。使用qRT-PCR分別檢測miRNA-340擬似物(miRNA-340 mimic)、miRNA-340 抑制物(miRNA-340inhibitor)慢病毒感染 Pig-1 細胞內的miRNA-340水平,證明miRNA-340過表達與低表達穩(wěn)轉細胞系構建成功。UVB照射Pig-1細胞(NC)及miRNA-340inhibitor低表達穩(wěn)轉細胞,照射后16h發(fā)現(xiàn)MITF、TYR、TYRP-1表達量均上調。UVB照射Pig-1細胞(NC)、過表達及低表達miRNA-340的穩(wěn)轉細胞后24h測定色素發(fā)現(xiàn),過表達miRNA-340穩(wěn)轉細胞組UVB照射后24h色素含量與NC組比顯著降低,低表達組與NC組比色素含量顯著增高。結論:miRNA-340靶向結合MITF的3'UTR特異性堿基抑制MITF表達并誘導其mRNA降解,同時可抑制色素合成通路的多個關鍵分子表達,下調UVB照射后黑素細胞產生色素的總量。綜上提示miRNA-340可能成為臨床治療UVB相關色素沉著性疾病以及制備美白制劑的新靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R751

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 李蕓;劉潔;孫秋寧;;黃褐斑的皮膚鏡學特征[J];中國醫(yī)學科學院學報;2015年02期

，

本文編號：1566495