本文關(guān)鍵詞： 梅毒螺旋體 人腦微血管內(nèi)皮細胞 粘附 基因芯片 趨化因子　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分 梅毒螺旋體粘附于人腦微血管內(nèi)皮細胞的實驗研究目的:觀察梅毒螺旋體與體外培養(yǎng)的人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMEC)的粘附方式和粘附規(guī)律。方法:將HBMEC接種于含細胞爬片的24孔細胞培養(yǎng)板中,加入8 × 106條/ml的梅毒螺旋體懸液共培養(yǎng),分別于0.5、2、4h后使用掃描電鏡分析梅毒螺旋體與HBMEC的粘附方式;加不同濃度(4 × 106條/ml、8 × 106條/ml、1.6 × 107條/ml)梅毒螺旋體懸液共培養(yǎng),分別于2、4、6、16h后運用暗視野顯微鏡計數(shù)單個HBMEC上粘附的梅毒螺旋體數(shù)量。實驗數(shù)據(jù)用重復(fù)測量資料的方差分析進行分析。結(jié)果:掃描電鏡結(jié)果顯示梅毒螺旋體集中粘附于HBMEC膜表面的某些區(qū)域,兩者在粘附的部位可發(fā)生融合。時間與濃度間存在交互作用(F=98.74,P0.001),在各濃度組,不同時間點細胞上粘附的螺旋體數(shù)目間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=387.72,P0.001),粘附的螺旋體數(shù)量隨著共培養(yǎng)時間的延長而逐漸增多,4h時達到高峰,然后逐漸降低。在4h時,不同濃度組間細胞上粘附的螺旋體數(shù)目間的差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=593.23,P0.001)。結(jié)論:梅毒螺旋體可以粘附于體外培養(yǎng)的HBMEC,梅毒螺旋體可能是通過菌體尖端與細胞膜溶解的方式與HBMEC粘附;1.6 × 107條/ml和共培養(yǎng)4h分別是梅毒螺旋體與HBMEC粘附的最佳濃度和時間。第二部分梅毒螺旋體刺激后人腦微血管內(nèi)皮細胞基因表達譜分析及差異表達基因的功能分析目的:探討梅毒螺旋體粘附對人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMEC)基因表達譜的影響,分析差異表達基因的功能,從mRNA水平了解HBMEC對梅毒螺旋體的反應(yīng)。方法:構(gòu)建HBMEC單層模型,加入1.6 ×107條/ml的梅毒螺旋體懸液,以未加螺旋體的HBMEC作為對照,4h后提取細胞RNA,利用Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression Microarray(8×60K)基因芯片檢測 HBMEC 的基因表達譜,篩選差異表達基因。利用GO和KEGG富集法分析差異表達基因的功能,利用qRT-PCR對7個感興趣的差異表達基因進行驗證。結(jié)果:基因芯片共篩選出249個差異表達的基因,包括218個上調(diào)表達的基因和31個下調(diào)表達的基因。GO富集分析結(jié)果顯示差異表達基因共參與38個GO terms,其中生物學(xué)過程、分子功能、細胞成分的terms數(shù)目分別為27、6和5,內(nèi)皮細胞活化、宿主細胞免疫反應(yīng)和細菌粘附等多個生物學(xué)過程。KEGG富集分析結(jié)果顯示差異表達基因富集于12條信號通路中,兩者相互作用過程可能涉及 Th1 7 cell differentiation 通路和 Cell adhesion molecules 通路。qRT-PCR 結(jié)果顯示 RARRES2、ADAMTS5、F3、MACF1 和 DCN 表達上調(diào),CLDN4和LDLR表達下調(diào),與基因芯片結(jié)果基本一致。結(jié)論:梅毒螺旋體可改變HBMEC的基因表達譜,差異表達基因廣泛參與多個生物學(xué)過程。梅毒螺旋體粘附后的HBMEC被激活,同時發(fā)起一系列免疫防御對抗螺旋體的侵襲。該基因芯片分析結(jié)果為進一步研究人腦微血管內(nèi)皮細胞在神經(jīng)梅毒發(fā)病機制中的作用提供新的平臺和研究方向。第三部分梅毒螺旋體對人腦微血管內(nèi)皮細胞中多個趨化因子配體表達的影響目的:探索梅毒螺旋體對HBMEC中趨化因子配體(CXCL)表達的影響。方法:將HBMEC接種于6孔或96孔細胞培養(yǎng)板中,分為梅毒螺旋體組、滅活梅毒螺旋體、脂多糖組和空白對照組,分別加入梅毒螺旋體、滅活的梅毒螺旋體、脂多糖和細胞培養(yǎng)液培養(yǎng),于6、12、24h后分別用熒光定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測細胞中CXCL-6、CXCL-8、CXCL-10和CXCL-13的基因表達水平和蛋白表達水平。利用Transwell小室細胞遷移實驗檢測梅毒螺旋體刺激后HBMEC對人早幼粒細胞白血病細胞(HL-60)的趨化作用。結(jié)果:在各時間點,梅毒螺旋體組中CXCL-6、CXCL-8和CXCL-10的mRNA表達水平均顯著高于空白對照組和滅活梅毒螺旋體組(均P0.05),而滅活梅毒螺旋體組與空白對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)。各組細胞中CXCL-13的mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在各時間點,梅毒螺旋體組中CXCL-6和CXCL-8的含量均高于空白對照組和滅活梅毒螺旋體組(均P0.05),而滅活梅毒螺旋體組與空白對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05);在各時間點,梅毒螺旋體組細胞培養(yǎng)上清液中CXCL-10的含量與空白對照組和滅活梅毒螺旋體組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P0.05)。在各時間點,梅毒螺旋體組的吸光值均高于空白對照組和滅活梅毒螺旋體組(均P0.05)。結(jié)論:梅毒螺旋體可上調(diào)HBMEC中CXCL-6、CXCL-8和CXCL-10的基因表達水平,增加CXCL-6和CXCL-8的分泌,增強HBMEC對HL-60細胞的趨化作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R759.1

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本文編號：1552197