本文關(guān)鍵詞： 梅毒螺旋體 人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 粘附 基因芯片 趨化因子　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分 梅毒螺旋體粘附于人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究目的:觀察梅毒螺旋體與體外培養(yǎng)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)的粘附方式和粘附規(guī)律。方法:將HBMEC接種于含細(xì)胞爬片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,加入8 × 106條/ml的梅毒螺旋體懸液共培養(yǎng),分別于0.5、2、4h后使用掃描電鏡分析梅毒螺旋體與HBMEC的粘附方式;加不同濃度(4 × 106條/ml、8 × 106條/ml、1.6 × 107條/ml)梅毒螺旋體懸液共培養(yǎng),分別于2、4、6、16h后運(yùn)用暗視野顯微鏡計(jì)數(shù)單個(gè)HBMEC上粘附的梅毒螺旋體數(shù)量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用重復(fù)測量資料的方差分析進(jìn)行分析。結(jié)果:掃描電鏡結(jié)果顯示梅毒螺旋體集中粘附于HBMEC膜表面的某些區(qū)域,兩者在粘附的部位可發(fā)生融合。時(shí)間與濃度間存在交互作用(F=98.74,P0.001),在各濃度組,不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上粘附的螺旋體數(shù)目間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=387.72,P0.001),粘附的螺旋體數(shù)量隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸增多,4h時(shí)達(dá)到高峰,然后逐漸降低。在4h時(shí),不同濃度組間細(xì)胞上粘附的螺旋體數(shù)目間的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=593.23,P0.001)。結(jié)論:梅毒螺旋體可以粘附于體外培養(yǎng)的HBMEC,梅毒螺旋體可能是通過菌體尖端與細(xì)胞膜溶解的方式與HBMEC粘附;1.6 × 107條/ml和共培養(yǎng)4h分別是梅毒螺旋體與HBMEC粘附的最佳濃度和時(shí)間。第二部分梅毒螺旋體刺激后人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)譜分析及差異表達(dá)基因的功能分析目的:探討梅毒螺旋體粘附對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)基因表達(dá)譜的影響,分析差異表達(dá)基因的功能,從mRNA水平了解HBMEC對(duì)梅毒螺旋體的反應(yīng)。方法:構(gòu)建HBMEC單層模型,加入1.6 ×107條/ml的梅毒螺旋體懸液,以未加螺旋體的HBMEC作為對(duì)照,4h后提取細(xì)胞RNA,利用Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression Microarray(8×60K)基因芯片檢測 HBMEC 的基因表達(dá)譜,篩選差異表達(dá)基因。利用GO和KEGG富集法分析差異表達(dá)基因的功能,利用qRT-PCR對(duì)7個(gè)感興趣的差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:基因芯片共篩選出249個(gè)差異表達(dá)的基因,包括218個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因和31個(gè)下調(diào)表達(dá)的基因。GO富集分析結(jié)果顯示差異表達(dá)基因共參與38個(gè)GO terms,其中生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞成分的terms數(shù)目分別為27、6和5,內(nèi)皮細(xì)胞活化、宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)和細(xì)菌粘附等多個(gè)生物學(xué)過程。KEGG富集分析結(jié)果顯示差異表達(dá)基因富集于12條信號(hào)通路中,兩者相互作用過程可能涉及 Th1 7 cell differentiation 通路和 Cell adhesion molecules 通路。qRT-PCR 結(jié)果顯示 RARRES2、ADAMTS5、F3、MACF1 和 DCN 表達(dá)上調(diào),CLDN4和LDLR表達(dá)下調(diào),與基因芯片結(jié)果基本一致。結(jié)論:梅毒螺旋體可改變HBMEC的基因表達(dá)譜,差異表達(dá)基因廣泛參與多個(gè)生物學(xué)過程。梅毒螺旋體粘附后的HBMEC被激活,同時(shí)發(fā)起一系列免疫防御對(duì)抗螺旋體的侵襲。該基因芯片分析結(jié)果為進(jìn)一步研究人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞在神經(jīng)梅毒發(fā)病機(jī)制中的作用提供新的平臺(tái)和研究方向。第三部分梅毒螺旋體對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中多個(gè)趨化因子配體表達(dá)的影響目的:探索梅毒螺旋體對(duì)HBMEC中趨化因子配體(CXCL)表達(dá)的影響。方法:將HBMEC接種于6孔或96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,分為梅毒螺旋體組、滅活梅毒螺旋體、脂多糖組和空白對(duì)照組,分別加入梅毒螺旋體、滅活的梅毒螺旋體、脂多糖和細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng),于6、12、24h后分別用熒光定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測細(xì)胞中CXCL-6、CXCL-8、CXCL-10和CXCL-13的基因表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平。利用Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測梅毒螺旋體刺激后HBMEC對(duì)人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞(HL-60)的趨化作用。結(jié)果:在各時(shí)間點(diǎn),梅毒螺旋體組中CXCL-6、CXCL-8和CXCL-10的mRNA表達(dá)水平均顯著高于空白對(duì)照組和滅活梅毒螺旋體組(均P0.05),而滅活梅毒螺旋體組與空白對(duì)照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。各組細(xì)胞中CXCL-13的mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在各時(shí)間點(diǎn),梅毒螺旋體組中CXCL-6和CXCL-8的含量均高于空白對(duì)照組和滅活梅毒螺旋體組(均P0.05),而滅活梅毒螺旋體組與空白對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05);在各時(shí)間點(diǎn),梅毒螺旋體組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CXCL-10的含量與空白對(duì)照組和滅活梅毒螺旋體組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。在各時(shí)間點(diǎn),梅毒螺旋體組的吸光值均高于空白對(duì)照組和滅活梅毒螺旋體組(均P0.05)。結(jié)論:梅毒螺旋體可上調(diào)HBMEC中CXCL-6、CXCL-8和CXCL-10的基因表達(dá)水平,增加CXCL-6和CXCL-8的分泌,增強(qiáng)HBMEC對(duì)HL-60細(xì)胞的趨化作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R759.1

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本文編號(hào)：1552197