本文關(guān)鍵詞： 鈣網(wǎng)織蛋白(CRT) C1q受體球狀結(jié)構(gòu)域(gC1qR) CRT/gC1qR復(fù)合體 黑素細(xì)胞 氧化應(yīng)激 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 白癜風(fēng)　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:黑素細(xì)胞破壞或凋亡導(dǎo)致白癜風(fēng)發(fā)病的機(jī)制是皮膚科研究熱點(diǎn)之一。越來越多的證據(jù)表明,氧化應(yīng)激直接導(dǎo)致黑素細(xì)胞損傷或凋亡并啟動(dòng)異常免疫應(yīng)答,是尋常型白癜風(fēng)發(fā)病的重要機(jī)制。鈣網(wǎng)織蛋白(CRT)又稱cC1qR,是補(bǔ)體C1q的主要受體之一,而C1q的另一受體gC1qR表達(dá)于除紅細(xì)胞外的幾乎所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞,在炎癥反應(yīng)、病毒感染、腫瘤轉(zhuǎn)移、調(diào)控細(xì)胞凋亡中有重要作用。gC1qR進(jìn)入細(xì)胞線粒體內(nèi)蓄積,能導(dǎo)致線粒體功能障礙,促進(jìn)凋亡;而gC1qR與CRT形成CRT/gC1qR復(fù)合體則可阻止gC1qR線粒體和核轉(zhuǎn)位,促進(jìn)細(xì)胞增殖或遷移。氧化應(yīng)激可影響CRT、gC1qR蛋白表達(dá)和亞細(xì)胞定位,但在表皮組織中,角質(zhì)形成細(xì)胞與黑素細(xì)胞應(yīng)對(duì)氧化損傷有不同模式,CRT、gC1qR的定位及功能變化尚不明確,CRT/gC1qR復(fù)合體的存在與否對(duì)兩種細(xì)胞的影響也亟待闡明。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn):過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激時(shí),黑素細(xì)胞中的CRT翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜表面,促進(jìn)部分炎癥因子的表達(dá)。提示白癜風(fēng)發(fā)病早期,氧化應(yīng)激介導(dǎo)黑素細(xì)胞免疫原性增強(qiáng),啟動(dòng)并促進(jìn)自身免疫應(yīng)答。但CRT膜外翻的具體機(jī)制尚不明確,更關(guān)鍵的是尚未獲得crt參與黑素細(xì)胞免疫損傷的確切證據(jù);另外,角質(zhì)形成細(xì)胞中相關(guān)分子的表達(dá)也值得關(guān)注�；谇笆鼋Y(jié)果,我們提出如下假說:氧化應(yīng)激誘導(dǎo)黑素細(xì)胞內(nèi)部顯著的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體應(yīng)激,導(dǎo)致crt膜外聚集,gc1qr發(fā)生線粒體轉(zhuǎn)位,二者共同作用促進(jìn)細(xì)胞凋亡;而角質(zhì)形成細(xì)胞中,crt與gc1qr形成crt/gc1qr復(fù)合體,降低細(xì)胞損傷。目的:1.探討氧化應(yīng)激下調(diào)控crt的信號(hào)通路及crt在氧化應(yīng)激介導(dǎo)黑素細(xì)胞免疫損傷中的證據(jù);2.明確gc1qr、crt/gc1qr復(fù)合體在黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)模式及參與氧化損傷的機(jī)制。方法:1.應(yīng)用激光共聚焦組織免疫熒光技術(shù),觀察白癜風(fēng)患者及正常人表皮黑素細(xì)胞中crt定位的差異;2.通過應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞早凋/壞死比例,體外構(gòu)建h2o2誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞氧化應(yīng)激模型,應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察細(xì)胞模型中crt的定位;3.應(yīng)用real-timepcr、westernblot篩選上游調(diào)控crt表達(dá)的信號(hào)通路;并通過干涉片段對(duì)初篩結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,激光共聚焦組織免疫熒光技術(shù)觀察白癜風(fēng)患者及正常人表皮中所篩選相關(guān)通路標(biāo)志分子的表達(dá);同時(shí)通過分離胞膜蛋白,進(jìn)一步明確上游信號(hào)對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中crt的調(diào)控機(jī)制;4.建立pig1細(xì)胞與白癜風(fēng)患者pbmc共孵育模型,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)及elisa檢測不同條件處理后的共孵育模型中cd8+t細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子ifn-γ的表達(dá)水平、dc細(xì)胞成熟標(biāo)志物cd80、cd86、hla-dr的表達(dá)差異;5.應(yīng)用real-timepcr、westernblot技術(shù)檢測細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中g(shù)c1qr的表達(dá),并應(yīng)用激光共聚焦免疫熒光觀察gc1qr的亞細(xì)胞器定位變化;6.應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)分析氧化應(yīng)激模型中crt與gc1qr的相互作用及crt/gc1qr復(fù)合體的形成,并通過westernblot、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察crt、gc1qr、crt/gc1qr的表達(dá)與定位情況;7.分別應(yīng)用crt與gc1qr的干涉片段處理細(xì)胞后,觀察氧化應(yīng)激條件下二者及crt/gc1qr復(fù)合體對(duì)細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位及細(xì)胞ros水平的影響;8.通過質(zhì)譜分析及string在線軟件對(duì)黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中影響crt/gc1qr復(fù)合體形成的靶蛋白進(jìn)行預(yù)測和分析。結(jié)果:1.crt生理、病理狀態(tài)的定位:(1)正常人表皮組織中的黑素細(xì)胞crt定位于胞漿;而白癜風(fēng)表皮組織中殘留的黑素細(xì)胞crt表達(dá)增加且于胞膜上出現(xiàn)crt的定位;(2)濃度梯度h2o2處理黑素細(xì)胞(pig1、原代mc)及作為對(duì)照的角質(zhì)形成細(xì)胞(hacat、原代kc)12h,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡并選擇早期凋亡有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異而壞死無差異的h2o2濃度作為所構(gòu)建氧化應(yīng)激模型的實(shí)驗(yàn)濃度,即pig1與原代mc細(xì)胞為:400μm,hacat及原代kc細(xì)胞為:800μm;本實(shí)驗(yàn)濃度可以成功誘導(dǎo)黑素細(xì)胞中crt與dii標(biāo)記的細(xì)胞膜共定位(crt膜外翻/聚集),并可以在mrna及蛋白水平以時(shí)間梯度依賴性誘導(dǎo)crt的上調(diào);角質(zhì)形成細(xì)胞中未見時(shí)間依賴性的crt膜外翻。2.氧化應(yīng)激誘導(dǎo)crt與gc1qr表達(dá)與功能變化:(1)h2o2構(gòu)建的黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激模型引起gc1qr的表達(dá)上調(diào)及線粒體轉(zhuǎn)位,且具時(shí)間依賴性;與黑素細(xì)胞不同的是,角質(zhì)形成細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中g(shù)c1qr的表達(dá)下調(diào),且主要表達(dá)于細(xì)胞漿,并未發(fā)生顯著的線粒體轉(zhuǎn)位;(2)黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激模型誘導(dǎo)的crt膜聚集和gc1qr線粒體轉(zhuǎn)位,兩者在細(xì)胞內(nèi)無共定位現(xiàn)象;而角質(zhì)形成細(xì)胞氧化應(yīng)激模型則誘導(dǎo)部分crt與gc1qr形成復(fù)合體。3.crt與gc1qr在氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞中的機(jī)制:(1)體外氧化應(yīng)激模型可以誘導(dǎo)黑素細(xì)胞未折疊蛋白反應(yīng)upr發(fā)生的同時(shí),激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激經(jīng)典的信號(hào)通路;其中perk相關(guān)通路的激活主要調(diào)控了黑素細(xì)胞crt的膜聚集,且具有顯著的時(shí)間依賴性;白癜風(fēng)皮損旁組織與正常對(duì)照組織相比磷酸化perk高表達(dá);irei"及atf6相關(guān)通路的激活與黑素細(xì)胞膜型crt的表達(dá)無關(guān);(2)體外與hla分型一致的患者pbmc構(gòu)建的共孵育模型發(fā)現(xiàn),黑素細(xì)胞crt的膜聚集導(dǎo)致cd8+t細(xì)胞增殖并促進(jìn)ifn-#的產(chǎn)生;同時(shí)可以促進(jìn)dc細(xì)胞表面成熟標(biāo)志物cd86及hla-dr的表達(dá);(3)氧化應(yīng)激下,黑素細(xì)胞中的CRT與gC1qR均參與細(xì)胞的凋亡,發(fā)揮促凋亡的作用,其中CRT主要導(dǎo)致細(xì)胞早期凋亡,gC1qR可以導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜發(fā)生去極化、膜電位下降,并引起胞內(nèi)ROS的蓄積;與黑素細(xì)胞相反,角質(zhì)形成細(xì)胞中CRT/gC1qR復(fù)合體的形成阻止了CRT引起的細(xì)胞早凋、gC1qR誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降及胞內(nèi)ROS的蓄積;SRSF1、NCAPD2、HSP90AA1、SCARF1、TUBB2C可能與黑素細(xì)胞CRT競爭結(jié)合gC1qR從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。結(jié)論:1.本課題闡明了氧化應(yīng)激條件下,調(diào)控白癜風(fēng)黑素細(xì)胞CRT膜聚集的上游分子通路,證實(shí)CRT膜聚集可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞免疫損傷,明確了CRT、gC1qR在氧化應(yīng)激黑素細(xì)胞損傷中的作用;2.揭示黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞中CRT、gC1qR不同表達(dá)模式的分子基礎(chǔ),對(duì)闡明和理解氧化應(yīng)激誘發(fā)白癜風(fēng)的機(jī)制具有重要意義。
[Abstract]:BACKGROUND : The pathogenesis of vitiligo is one of the hot spots in Dermatology . It is shown that oxidative stress plays an important role in the pathogenesis of vitiligo . the expression of cd8 + t cells , the expression of cd8 + t cells , the expression of cd8 + t cells , the expression of cd8 + t cells and the expression of cd8 + t cells in the epidermal tissues of normal controls were investigated by means of immuno - co - precipitation technique . ( 1 ) In vitro oxidative stress model , CRT and gC1qR are involved in the proliferation of the cells and the accumulation of intracellular ROS . ( 2 ) In vitro , CRT / gC1qR induces apoptosis in the cells and promotes the accumulation of intracellular ROS .

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R758.41

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本文編號(hào)：1530360