本文關(guān)鍵詞： 蠕形螨 酸性磷酸酶 堿性磷酸酶 染色 正交試驗(yàn)法 ISSR-PCR 梯度PCR 反應(yīng)條件　出處：《山東大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的探索毛囊蠕形螨、皮脂蠕形螨和山羊蠕形螨體內(nèi)兩種酶的染色方法：酸性磷酸酶染色采用Gomori鉛-二甲基亞砜法(dimethyl sulfoxide, DMSO);堿性磷酸酶染色采用偶氮偶聯(lián)法(Kaplow法),確定這兩種酶在螨體內(nèi)的存在及分布情況。為進(jìn)一步研究這兩種酶在螨體內(nèi)的生理功能和致病性打下基礎(chǔ)。 改良山羊蠕形螨基因組DNA的提取方法,用正交試驗(yàn)法篩選出山羊蠕形螨ISSR-PCR (Inter-simple sequence repeat polymerase chain reaction)的最佳反應(yīng)體系,并用梯度PCR方法篩選出此PCR的最佳退火溫度,為利用ISSR分子標(biāo)記研究蠕形螨的遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)。 方法用自制刮片式取螨器加壓刮取人額部皮脂,用鑷式取螨器加壓刮取人鼻翼處皮脂；切開新鮮山羊皮下結(jié)節(jié)取出其中干酪樣物；將樣本與洗潔精混合均勻,在解剖鏡直視下,用自制挑螨針將螨從皮脂中分離并反復(fù)清洗干凈并分類。將潔凈螨體置于雙蒸水中,于-20℃冰箱中冷凍24小時(shí)后,采用蠕形螨整體染色法染色：用Gomori鉛-DMSO法對(duì)三種蠕形螨酸性磷酸酶進(jìn)行染色,用偶氮偶聯(lián)法對(duì)三種蠕形螨的堿性磷酸酶進(jìn)行染色,并分別設(shè)立去底物陰性對(duì)照組。 用自然沉降法收集山羊蠕形螨,用基因組DNA提取試劑盒提取山羊蠕形螨DNA并以此為模板,以加拿大British Columbia大學(xué)設(shè)計(jì)的ISSR引物序列UBC848: (CA)8RG (R為一分子的嘧啶)為引物,利用正交試驗(yàn)法,建立一個(gè)L16(45) (L表示正交表；16表示有16行,即安排16次試驗(yàn)；5表示5列,即有五個(gè)因素；4表示每列有四個(gè)水平)的正交表,從Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物用量、DNA模板用量和TaqDNA聚合酶5個(gè)因素、各4個(gè)水平對(duì)山羊蠕形螨ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,用極差分析和方差分析分析結(jié)果,并根據(jù)篩選出的最佳水平組合,用梯度PCR的方法篩選PCR反應(yīng)過(guò)程的最佳退火溫度。 結(jié)果經(jīng)過(guò)染色,三種蠕形螨體內(nèi)酸性磷酸酶所在部位被染成棕黃色,堿性磷酸酶所在部位被染成紫藍(lán)色或紫黑色,陰性對(duì)照組均不顯色。 找出了一種快速清洗山羊蠕形螨及提取山羊蠕形螨基因組DNA的方法,大大縮短了DNA提取時(shí)間。通過(guò)正交試驗(yàn)法,篩選出山羊蠕形螨ISSR-PCR的最佳反應(yīng)體系,即25μ1反應(yīng)體系中包括：1×PCR緩沖液,2.0mmol/L Mg2+ 0.4mmol/LdNTPs,30pmol引物,30～60ng模板DNA,2.0U Taq晦。通過(guò)梯度PCR試驗(yàn)篩選出引物UBC848的最佳退火溫度為49℃。 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)用Gomori鉛-DMSO法對(duì)三種蠕形螨酸性磷酸酶染色,用偶氮偶聯(lián)法對(duì)三種蠕形螨堿性磷酸酶染色,結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組三種蠕形螨體內(nèi)都有不同程度的著色,再次證明了三種蠕形螨體內(nèi)都有酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的存在,為進(jìn)一步研究這兩種酶在螨體內(nèi)的生理功能和致病性打下基礎(chǔ)。結(jié)果還顯示不同時(shí)期、不同種類的螨體著色強(qiáng)弱有差異,說(shuō)明不同時(shí)期、不同種類的蠕形螨體內(nèi)酶的活性不同。 正交試驗(yàn)法既可分析不同因素之間的交互作用,又可得出正交表中最佳處理組合,還可以分析每一因素不同水平對(duì)擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生的影響,從中得出最優(yōu)水平的組合,彌補(bǔ)了單因素試驗(yàn)法和完全組合設(shè)計(jì)的不足,本試驗(yàn)選用L16(45)正交表,1次進(jìn)行了16組PCR擴(kuò)增,分析了Mg2+、dNTPs、引物、DNA模板和Taq DNA聚合酶對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響,得出了穩(wěn)定且重復(fù)性好的ISSR反應(yīng)體系；并通過(guò)梯度PCR法篩選出了引物UBC848的最佳退火溫度為49℃,這一擴(kuò)增體系和退火溫度的建立為今后利用ISSR標(biāo)記研究蠕形螨的遺傳多樣性做了前期準(zhǔn)備。
[Abstract]:鐩殑鎺㈢儲(chǔ)姣涘泭锠曞艦铻，

本文編號(hào)：1526473