發(fā)布時(shí)間：2018-02-01 15:12

  本文關(guān)鍵詞： 黑素瘤 CCL18 miR-128 RNAi 惡性行為　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：皮膚惡性黑素瘤(cutaneous malignant melanoma,CMM)是一種高度惡性的皮膚腫瘤,具有侵襲性強(qiáng)、易早期發(fā)生轉(zhuǎn)移、致死率高等特點(diǎn)。黑素瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞與腫瘤浸潤(rùn)微環(huán)境通過(guò)細(xì)胞因子等分子信號(hào)相互作用的結(jié)果,腫瘤浸潤(rùn)微環(huán)境中的關(guān)鍵分子對(duì)腫瘤的診斷和靶向治療具有重要意義,成為腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)趨化因子CCL18在CMM組織中表達(dá)上調(diào),并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)CCL18具有促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用,是黑素瘤的潛在致病基因。本研究從RNAi方面開(kāi)展皮膚黑素瘤CCL18表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究,明確miR-128及CCL18在黑素瘤組織中的表達(dá)及其關(guān)系,初步探索miR-128靶向CCL18調(diào)控黑素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用,篩選出高效沉默CCL18的miRNA分子,為黑素瘤的治療提供新的切入點(diǎn)。第一部分CCL18在皮膚黑素瘤組織、患者血清中的表達(dá)及意義本課題組前期通過(guò)全基因組表達(dá)芯片技術(shù)進(jìn)行差異表達(dá)譜分析,發(fā)現(xiàn)CCL18基因在中國(guó)人肢端黑素瘤(acral lentiginous melanoma,ALM)患者的腫瘤組織中表達(dá)發(fā)生明顯上調(diào),并通過(guò)免疫組化方法初步驗(yàn)證CCL18在CMM中的表達(dá)高于色素痣,而且CCL18水平在Clark分級(jí)≥Ⅱ級(jí)的黑素瘤明顯高于Clark分級(jí)Ⅰ級(jí)的黑素瘤。為探討趨化因子CCL18表達(dá)與皮膚黑素瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程的關(guān)系,我們通過(guò)real-time PCR、ELISA分析,發(fā)現(xiàn)CMM患者組織中CCL18 mRNA及血清中CCL18蛋白水平明顯增高。此外我們擴(kuò)大樣本量通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)CCL18在58例CMM及50例色素痣中的表達(dá),并分析CCL18表達(dá)水平與黑素瘤臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果證實(shí)CCL18在CMM中表達(dá)增加,其表達(dá)水平與腫瘤Clark分級(jí)、Breslow厚度及VEGF表達(dá)呈正相關(guān)性,并且CCL18在腫瘤發(fā)生潰瘍及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況時(shí)表達(dá)水平較高�？梢�(jiàn)CCL18在CMM組織中呈異常高表達(dá),并且其表達(dá)水平與CMM惡性程度密切相關(guān)。此外,免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)皮膚惡性黑素瘤組織中腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)CCL18。第二部分靶向調(diào)控CCL18基因的miRNAs生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及篩選通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)靶向調(diào)控CCL18的miRNAs,并應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法對(duì)預(yù)測(cè)的miRNAs與CCL18基因3' UTR的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證。采用real-time PCR法檢測(cè)14例CMM新鮮組織中CCL18和預(yù)測(cè)的miRNAs的表達(dá),并分析相關(guān)性,其中miR-128在CMM中表達(dá)降低,而且與CCL18的表達(dá)具有顯著負(fù)相關(guān)性。結(jié)果表明miR-128可能是靶向沉默CCL18基因的miRNA分子。第三部分靶向沉默CCL18基因的miR-128調(diào)控效應(yīng)分析前文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-128可能是靶向調(diào)控CCL18基因的miRNA分子,我們將miR-128作為研究對(duì)象。通過(guò)RNAi研究miR-128對(duì)CCL18表達(dá)的調(diào)控,以及miR-128調(diào)控CCL18對(duì)人黑素瘤細(xì)胞株A375生物學(xué)行為的影響及其可能機(jī)制。CCL18 在黑素瘤細(xì)胞株 A375、M14、MV3 和 SK-mel-28 中均不表達(dá),IL-4(20ng/ml)刺激人外周血單核細(xì)胞可產(chǎn)生CCL18。因此我們采用單核細(xì)胞與A375細(xì)胞株共培養(yǎng)的方法模擬腫瘤浸潤(rùn)微環(huán)境,采用攜帶miR-128 mimics的腺病毒轉(zhuǎn)染單核細(xì)胞,同時(shí)用陰性對(duì)照腺病毒設(shè)置對(duì)照。我們采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞集落形成能力,Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力,觀察各組A375細(xì)胞的體外生物學(xué)行為改變;進(jìn)一步通過(guò)Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中E-cadherin,N-cadherin及β-catenin表達(dá)情況。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染miR-128 mimics顯著降低單核細(xì)胞CCL18的表達(dá),能夠有效促進(jìn)人黑素瘤細(xì)胞株A375凋亡,抑制細(xì)胞跨膜遷移及克隆形成,但對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響。黑素瘤細(xì)胞中間質(zhì)型蛋白N-cadherin表達(dá)降低。miR-128沉默CCL18可能抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。結(jié)論在惡性黑素瘤組織及患者血清中,趨化因子CCL18表達(dá)均明顯上調(diào),且高表達(dá)與黑素瘤的惡性程度相關(guān)。miR-128能夠作用于CCL18基因的3'UTR發(fā)揮靶向沉默作用。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明miR-128靶向沉默CCL18表達(dá)可促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞A375調(diào)亡,明顯降低其克隆形成及遷移運(yùn)動(dòng)能力,影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而部分抑制CCL18的促癌作用�？梢�(jiàn),趨化因子CCL18與惡性黑素瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),CCL18在促進(jìn)黑素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到重要作用,miR-128可能是靶向沉默CCL18基因的miRNA分子。CCL18可能成為黑素瘤診斷和治療中新的靶向目標(biāo)。
[Abstract]:鐨偆鎭舵，

本文編號(hào)：1482161