發(fā)布時間：2018-02-01 15:12

  本文關鍵詞： 黑素瘤 CCL18 miR-128 RNAi 惡性行為　出處：《北京協和醫(yī)學院》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：皮膚惡性黑素瘤(cutaneous malignant melanoma,CMM)是一種高度惡性的皮膚腫瘤,具有侵襲性強、易早期發(fā)生轉移、致死率高等特點。黑素瘤的發(fā)展與轉移是腫瘤細胞與腫瘤浸潤微環(huán)境通過細胞因子等分子信號相互作用的結果,腫瘤浸潤微環(huán)境中的關鍵分子對腫瘤的診斷和靶向治療具有重要意義,成為腫瘤研究的熱點之一。本課題組前期研究發(fā)現趨化因子CCL18在CMM組織中表達上調,并通過體外實驗證實CCL18具有促進黑素瘤細胞侵襲轉移的作用,是黑素瘤的潛在致病基因。本研究從RNAi方面開展皮膚黑素瘤CCL18表達調控機制的研究,明確miR-128及CCL18在黑素瘤組織中的表達及其關系,初步探索miR-128靶向CCL18調控黑素瘤細胞侵襲轉移的作用,篩選出高效沉默CCL18的miRNA分子,為黑素瘤的治療提供新的切入點。第一部分CCL18在皮膚黑素瘤組織、患者血清中的表達及意義本課題組前期通過全基因組表達芯片技術進行差異表達譜分析,發(fā)現CCL18基因在中國人肢端黑素瘤(acral lentiginous melanoma,ALM)患者的腫瘤組織中表達發(fā)生明顯上調,并通過免疫組化方法初步驗證CCL18在CMM中的表達高于色素痣,而且CCL18水平在Clark分級≥Ⅱ級的黑素瘤明顯高于Clark分級Ⅰ級的黑素瘤。為探討趨化因子CCL18表達與皮膚黑素瘤的發(fā)生發(fā)展過程的關系,我們通過real-time PCR、ELISA分析,發(fā)現CMM患者組織中CCL18 mRNA及血清中CCL18蛋白水平明顯增高。此外我們擴大樣本量通過免疫組化方法檢測CCL18在58例CMM及50例色素痣中的表達,并分析CCL18表達水平與黑素瘤臨床病理特征的關系。結果證實CCL18在CMM中表達增加,其表達水平與腫瘤Clark分級、Breslow厚度及VEGF表達呈正相關性,并且CCL18在腫瘤發(fā)生潰瘍及淋巴結轉移情況時表達水平較高�？梢奀CL18在CMM組織中呈異常高表達,并且其表達水平與CMM惡性程度密切相關。此外,免疫熒光實驗證實皮膚惡性黑素瘤組織中腫瘤細胞胞質表達CCL18。第二部分靶向調控CCL18基因的miRNAs生物信息學預測及篩選通過生物信息學分析預測靶向調控CCL18的miRNAs,并應用熒光素酶報告基因檢測法對預測的miRNAs與CCL18基因3' UTR的相互作用進行驗證。采用real-time PCR法檢測14例CMM新鮮組織中CCL18和預測的miRNAs的表達,并分析相關性,其中miR-128在CMM中表達降低,而且與CCL18的表達具有顯著負相關性。結果表明miR-128可能是靶向沉默CCL18基因的miRNA分子。第三部分靶向沉默CCL18基因的miR-128調控效應分析前文實驗結果表明miR-128可能是靶向調控CCL18基因的miRNA分子,我們將miR-128作為研究對象。通過RNAi研究miR-128對CCL18表達的調控,以及miR-128調控CCL18對人黑素瘤細胞株A375生物學行為的影響及其可能機制。CCL18 在黑素瘤細胞株 A375、M14、MV3 和 SK-mel-28 中均不表達,IL-4(20ng/ml)刺激人外周血單核細胞可產生CCL18。因此我們采用單核細胞與A375細胞株共培養(yǎng)的方法模擬腫瘤浸潤微環(huán)境,采用攜帶miR-128 mimics的腺病毒轉染單核細胞,同時用陰性對照腺病毒設置對照。我們采用CCK8法檢測細胞增殖能力,流式細胞技術檢測細胞凋亡,克隆形成實驗檢測細胞集落形成能力,Transwell小室實驗檢測細胞運動遷移能力,觀察各組A375細胞的體外生物學行為改變;進一步通過Western blot方法檢測細胞中E-cadherin,N-cadherin及β-catenin表達情況。結果表明,轉染miR-128 mimics顯著降低單核細胞CCL18的表達,能夠有效促進人黑素瘤細胞株A375凋亡,抑制細胞跨膜遷移及克隆形成,但對細胞增殖無影響。黑素瘤細胞中間質型蛋白N-cadherin表達降低。miR-128沉默CCL18可能抑制上皮間質轉化,影響腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。結論在惡性黑素瘤組織及患者血清中,趨化因子CCL18表達均明顯上調,且高表達與黑素瘤的惡性程度相關。miR-128能夠作用于CCL18基因的3'UTR發(fā)揮靶向沉默作用。體外細胞學實驗表明miR-128靶向沉默CCL18表達可促進黑素瘤細胞A375調亡,明顯降低其克隆形成及遷移運動能力,影響上皮間質轉化,從而部分抑制CCL18的促癌作用�？梢�,趨化因子CCL18與惡性黑素瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關,CCL18在促進黑素瘤的侵襲和轉移過程中起到重要作用,miR-128可能是靶向沉默CCL18基因的miRNA分子。CCL18可能成為黑素瘤診斷和治療中新的靶向目標。
[Abstract]:鐨偆鎭舵，

本文編號：1482161