本文關(guān)鍵詞： 嗜酸粒細(xì)胞趨化因子 過敏 皮膚 角質(zhì)形成細(xì)胞 成纖維細(xì)胞 苦參方 RNA干擾 微乳　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 皮膚過敏性疾病是高發(fā)的變態(tài)反應(yīng)型疾病,是當(dāng)皮膚暴露于外界過敏原時,由全身免疫系統(tǒng)參與而癥狀產(chǎn)生于局部的病理過程。除了在普通人群中常見外,對于在邊防、海島等惡劣環(huán)境下進(jìn)行工作與生活的部隊官兵,特別如遇戰(zhàn)事、災(zāi)害等嚴(yán)峻情況,影響尤為嚴(yán)重。因此,深入探討皮膚變態(tài)反應(yīng)性疾病的病理過程與機(jī)制,發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點和新的治療藥物,具有重要的科學(xué)價值與軍事意義。 變態(tài)反應(yīng)型疾病發(fā)病的確切機(jī)制目前仍不十分清楚,但炎癥細(xì)胞的募集是最終導(dǎo)致過敏性炎癥發(fā)生和發(fā)展原因。嗜酸粒細(xì)胞(eosinophils, Eos)是過敏性疾病中重要的效應(yīng)細(xì)胞,其浸潤于過敏部位,釋放毒性蛋白,造成組織損傷,導(dǎo)致炎癥發(fā)生。造成Eos局部浸潤的最重要的趨化因子是嗜酸粒細(xì)胞趨化因子(eotaxin/CCL11),因此eotaxin的表達(dá)與調(diào)控是過敏性疾病的重要環(huán)節(jié)和藥物治療靶點。 Eotaxin參與了皮膚過敏性疾病(如特異性皮炎、接觸性皮炎、藥物過敏性皮膚疾病等)的進(jìn)程已得到證實。而人體皮膚由表皮、真皮和皮下組織構(gòu)成,eotaxin在過敏皮膚中的確切表達(dá)部位及表達(dá)的動態(tài)過程目前還沒有證實。本研究中,我們以小鼠接觸性皮炎(ACD)模型為基礎(chǔ),探討了eotaxin在過敏環(huán)境下皮膚中的表達(dá)部位及動態(tài)特征。同時對皮膚過敏反應(yīng)的免疫學(xué)特征進(jìn)行了觀察,我們對CD4+和CDS+T淋巴細(xì)胞的浸潤的程度和時程進(jìn)行了比較。此外,為了闡明eotaxin表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,我們以構(gòu)成表皮層的角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)株HaCaT細(xì)胞和構(gòu)成真皮層的真皮成纖維細(xì)胞(FBs)為基礎(chǔ),使用TNF-a和IL-4刺激兩種細(xì)胞,觀察eotaxin分泌量的改變,并檢測與兩種因子相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和STAT6的激活情況,探討eotaxin表達(dá)的轉(zhuǎn)錄機(jī)制。 皮膚過敏性疾病的治療是本課題關(guān)注的重要內(nèi)容。相對于化學(xué)藥物治療,傳統(tǒng)藥物更顯示出開發(fā)成本低、療效好、副作用少、重視免疫平衡等優(yōu)點�？鄥⒎綖橐恢委熯^敏性皮膚病的傳統(tǒng)中醫(yī)藥方劑,其提取物的主要成份為苦參堿(Mat)、氧化苦參堿(Omt)、槐果堿(Sop)、氧化槐果堿(Osp)以及荊芥揮發(fā)油(SVO)。我們考察了苦參方提取物(KS)凝膠劑對小鼠接觸性皮炎的治療效果,同時檢測其對eotaxin的抑制作用,并于細(xì)胞水平對其提取物抑制TNF-a和IL-4誘導(dǎo)的eotaxin表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步闡述。 基因治療是目前疾病治療的一個研究熱點,我們嘗試性地對皮膚過敏性疾病的經(jīng)皮基因治療進(jìn)行了探索。微乳是經(jīng)皮給藥的一個良好劑型,將經(jīng)穩(wěn)定性修飾的eotaxin特異性siRNA制成W／O型微乳劑型,經(jīng)皮給藥,觀察其對小鼠接觸性皮炎治療效果及對eotaxin的在皮膚組織中表達(dá)的抑制作用。 第一部分：Eotaxin在皮膚過敏性疾病中的表達(dá)調(diào)控 (一) Eotaxin在小鼠接觸性皮炎(ACD)中的表達(dá)規(guī)律研究 1.小鼠接觸性皮炎模型的建立：以BALB/c小鼠為模型動物,用DNFB涂抹鼠耳,于第1、2天致敏和強(qiáng)化致敏,第5天激發(fā),可造成鼠耳皮膚過敏反應(yīng)；小鼠耳腫脹度呈現(xiàn)一動態(tài)過程,腫脹高峰出現(xiàn)在24h-48h,腫脹度可達(dá)0.26±0.04mm,炎癥待續(xù)5天左右,皮膚組織病理檢測結(jié)果、血液炎癥細(xì)胞計數(shù)證實了這一結(jié)論。其中Eos計數(shù)檢測中,激發(fā)前小鼠血Eos為0.19±0.042×107/L,激發(fā)后于1h-2h開始升高(1.94±0.12×107/L),至24h達(dá)到最高(6.63±1.12×107/L),72h開始減弱至5d恢復(fù)正常。此外,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測血中CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量比,免疫組織化學(xué)方法檢測組織中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的量,發(fā)現(xiàn)在過敏進(jìn)程中,血液和組織中的CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量都有不同幅度的增長。 2.采用原位雜交實驗技術(shù)檢測小鼠過敏皮膚中eotaxin mRNA表達(dá)情況,觀察到其主要產(chǎn)生于真皮層,少量產(chǎn)生于表皮層,同時血管內(nèi)皮和軟骨組織也有表達(dá),由此證明真皮成纖維細(xì)胞是eotaxin在過敏狀態(tài)下的主要來源。 3.分別采用real-time PCR、免疫組織化學(xué)和western-blotting檢測法檢測eotaxin在組織中表達(dá)的動態(tài)規(guī)律,及用ELISA檢測血清中eotaxin的濃度。發(fā)現(xiàn)激發(fā)后2h在組織中已經(jīng)開始有eotaxin的表達(dá),到6h-12h表達(dá)量到最大并持續(xù)到24h,之后有所下降,到72h,基本恢復(fù)到最初狀態(tài)。 (二) Eotaxin在皮膚細(xì)胞中產(chǎn)生的調(diào)控機(jī)制研究 1.采用不同濃度的TNF-α(1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL)和IL-4(2ng/mL、10 ng/mL,50ng/mL)分別與HaCaT細(xì)胞株和真皮成纖維細(xì)胞(FBs)共同孵育12h,用real-time PCR和ELISA方法檢測eotaxin mRNA和蛋白表達(dá)的情況,發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-4均能上調(diào)eotaxin的表達(dá),并呈劑量依賴性。而且無論是基礎(chǔ)表達(dá)還是在兩種細(xì)胞因子刺激下,FBs分泌eotaxin的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HaCaT細(xì)胞。當(dāng)同時使用TNF-α100 ng/mL和IL-4 10 ng/mL時,發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-4對兩種細(xì)胞中eotaxin mRNA和蛋白的上調(diào)均有協(xié)同作用。 2.分別或同時用100 ng／mL TNF-a和10 ng／mL IL-4與兩種細(xì)胞共同孵育,用real-time PCR和流式細(xì)胞術(shù)觀察eotaxin mRNA和蛋白在72h內(nèi)動態(tài)表達(dá)的動力學(xué)過程,發(fā)現(xiàn)FBs比HaCaT細(xì)胞較早地表達(dá)eotaxin,也較快達(dá)到高峰,同時衰減也較快,而HaCaT細(xì)胞表達(dá)eotaxin則較為緩慢和平穩(wěn),可持續(xù)較長時間。 3.通過EMSA和western-blotting分別檢測轉(zhuǎn)錄因子NF-κB核轉(zhuǎn)位和STAT6磷酸化的情況。在兩種皮膚細(xì)胞中,TNF-α和IL-4可以分別激活NF-κB和STAT6發(fā)生核轉(zhuǎn)位,而NF-κB特異性拮抗劑PDTC和轉(zhuǎn)錄因子STAT6特異的siRNA可以抑制TNF-α和IL-4引起的eotaxin上調(diào),從而證實兩種細(xì)胞受TNF-α和IL-4刺激后,均可通過NF-κB和STAT6轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致eotaxin的表達(dá)。 本部分研究證實了eotaxin在小鼠接觸性皮炎模型皮膚組織中表達(dá)有明顯上調(diào),并確定了表達(dá)的具體部位及動態(tài)過程。同時在離體細(xì)胞的研究中也證實和在體情況相似的表達(dá)特征,真皮成纖維細(xì)胞表達(dá)eotaxin的能力要高于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞。并且TNF-α和IL-4可以通過NF-κB和STAT6調(diào)節(jié)eotaxin的表達(dá)。 第二部分：苦參方提取物小鼠接觸性皮炎的治療作用及對eotaxin抑制作用研究 (一)苦參方提取物(KS)治療小鼠ACD的療效及機(jī)制研究 1.苦參方治療小鼠ACD療效觀察：采用檢測小鼠耳厚度的方法觀察藥物治療效果。致敏前耳厚度：0.37±0.03 mm；致敏24h：0.66±0.05 mm；1%苦參方凝膠干預(yù)組：0.47±0.04 mm；5%苦參方凝膠干預(yù)組：0.49±0.06 mm；西替利嗪干預(yù)組：0.50±0.04 mm；地塞米松干預(yù)組：0.41±0.04 mm。證實苦參方凝膠組可以顯著改善小鼠耳腫脹度(P0.01)。同時通過HE染色的病理切片觀察,也充分證明了藥物對炎癥細(xì)胞浸潤的改善作用。 2.采用流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化分別對血液和組織中CD4+和CD8+的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行了檢測,考察苦參方對機(jī)體免疫狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用。證明苦參方可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài),可降低CD4+和CD8+T細(xì)胞的組織浸潤和在血液中的募集。 3.小鼠全血Eos計數(shù)檢測�？鄥⒎侥z組可以顯著降低過敏導(dǎo)致的小鼠Eos升高(P0.01),小鼠致敏前Eos計數(shù)：0.19±0.04×107/L；致敏24 h：6.63±1.12×107,/L；1%苦參方凝膠干預(yù)組：4.78±0.66×107/L；5%苦參方凝膠干預(yù)組：2.24±0.58×107/L；西替利嗪組：5.22±0.73×107/L；地塞米松組：0.96±0.22×107/L 4. Real-time PCR、western-blotting、免疫組化法檢測eotaxin組織表達(dá)情況。結(jié)果表明苦參方凝膠劑可抑制eotaxin的表達(dá),證明eotaxin可能為苦參方的作用靶點之一。 (二)KS抑制皮膚細(xì)胞中eotaxin表達(dá)機(jī)制研究 1.MTT法檢測苦參提取物(KS)、荊芥揮發(fā)油(SVO)、Mat、Omt、Sop、Osp、鹽酸西替利嗪(Cet)、地塞米松磷酸鈉(Dex)對HaCaT細(xì)胞和FBs生存率的影響,證明KS和SVO≤500μg/mL, Mat、Omt、Sop、Osp≤1000μM、Cet≤200μM, Dex≤100μM時,對細(xì)胞生存率無顯著影響(≥90%),亦無刺激分裂和增殖作用。 2.通過real-time PCR、ELISA檢測KS、SVO、Mat、Omt、Sop、Osp對TNF-α和IL-4誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞和FBs產(chǎn)生的eotaxin的抑制作用,同時使用Cet、Dex進(jìn)行干預(yù),作為對照實驗。發(fā)現(xiàn)KS、SVO、Mat、Omt、Sop、Osp對eotaxin均有不同程度的抑制作用,抑制程度的順序為KS Mat Omt≈Sop Osp≈SVO。 3.通過EMSA和western-blotting分別檢測在兩種皮膚細(xì)胞中,Mat、Omt、Sop、Osp、SVO對TNF-a和IL-4誘導(dǎo)NF-κB和STAT6活化的抑制作用,證實Mat、Omt、Sop、Osp均可對NF-κB和STAT6的活化發(fā)生不同程度的抑制作用,但SVO只能夠部位抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位,而對STAT6磷酸化沒有明顯影響。 本部分研究證實了苦參方提取物對小鼠接觸性皮炎具有較好的治療效果,對小鼠過敏皮膚中eotaxin的表達(dá)及Eos的募集有明顯抑制作用,并可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)。并且證明苦參方提取物及其中主要有效成分可通過NF-κB和STAT6兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制TNF-a和IL-4引起的eotaxin上調(diào)。 第三部分：Eotaxin特異siRNA微乳治療小鼠接觸性皮炎初步研究 1. Eotaxin特異siRNA設(shè)計與篩選。設(shè)計三對小鼠eotaxin基因特異的siRNA,使用轉(zhuǎn)染試劑將siRNA轉(zhuǎn)染至小鼠成纖維細(xì)胞株NIH3T3,采用real-time PCR檢測TNF-a誘導(dǎo)下eotaxin被抑制的情況,得出eotaxin siRNA UTR為敲除效果最好的siRNA.采用ELISA檢測法證實siRNA抑制eotaxin分泌的效果。 2. Eotaxin siRNA微乳(ESM)的制備。eotaxin siRNA經(jīng)穩(wěn)定性修飾(甲氧修飾：糖的2'-OH變成2'-Ome)成stable eotaxin siRNA。處方：10% stable eotaxin siRNA(40.μg/mL或200μg／mL)水溶液,16% plurol oleique cc 497,16% labrasol,58% labrafac cc�？疾炝宋⑷榈牧健eta電位、粘度等性狀,并借助冷凍蝕刻電鏡觀察了微乳存在的狀態(tài)、使用激光共聚焦顯微鏡證明了經(jīng)熒光修飾的ESM (FAM-ESM)的包封效果。穩(wěn)定性考察證實,微乳本身可以存放于4℃、-20℃三個月不會發(fā)生性狀改變。且貯存于4℃, siRNA活性可以保持3個月,貯存于-20℃可以保持4個月。 3.ESM透皮動力學(xué)考察。利用小動物整體成像系統(tǒng)觀察裸鼠FAM-ESM透過皮膚和皮下擴(kuò)散的動態(tài)過程。ESM透皮吸收1h-2h可達(dá)平衡,并可在皮內(nèi)維持5h左右。與水溶液皮下注射組相比,微乳組的siRNA在皮內(nèi)可停留更長的時間。 4.ESM藥效學(xué)觀察。將ESM于小鼠ACD模型激發(fā)前24h涂于鼠耳,每日3次給藥,可以明顯改善過敏狀態(tài)下的小鼠耳腫脹程度(正常小鼠耳厚度：0.37±0.03mm,過敏小鼠(激發(fā)后24h)：0.66±0.05 mm,低劑量治療組：0.44±0.04 mm,P0.01；高劑量治療組：0.46±0.06 mm,P0.01),并無明顯不良反應(yīng)發(fā)生。且其對血液和組織中CD4+和CD8+T細(xì)胞的影響較小。 5.ESM對eotaxin的抑制作用考察。ESM可以顯著抑制過敏狀態(tài)下eotaxin的上調(diào),但對外周血Eos影響不大,且對炎癥細(xì)胞的組織浸潤影響較小。而提前48h給藥比提前藥24h給藥,在炎癥過程中對eotaxin有更好的敲除效果。 本部分研究制備了eotaxin特異siRNA微乳,證實了其透皮和治療效果,ESM對小鼠接觸性皮炎具有一定的治療效果,可以顯著抑制小鼠過敏皮膚中eotaxin的分泌。 通過本課題的研究,進(jìn)一步證實了eotaxin在過敏性皮膚疾病病理過程中的重要意義,揭示了eotaxin在過敏性皮膚疾病中的表達(dá)規(guī)律及調(diào)控機(jī)制。證明了中藥方劑苦參方治療過敏性皮膚疾病的治療效果和作用機(jī)制。初步探討了以RNAi為基礎(chǔ)的治療皮膚疾病的新的基因治療方式。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R758.2;R285

【參考文獻(xiàn)】

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1 王源,司維柯,李鵬,姚婕;苦參堿及氧化苦參堿抑制A549細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的比較研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2004年09期

2 裴仁九,肖玲,樊小平,劉錫鈞;苦參堿對小鼠免疫功能的影響[J];海峽藥學(xué);1998年02期

3 張鳳玲,唐永,張景梅;苦參堿、氧化苦參堿的藥理作用及其制劑的研究進(jìn)展[J];河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2004年03期

4 李正蓉;苦參素的藥理與臨床研究進(jìn)展[J];華西藥學(xué)雜志;2003年06期

5 金玉,張宏文;苦參堿及氧化苦參堿的抗纖維化作用研究進(jìn)展[J];中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志;2004年08期

6 余小虎,朱金水,俞華芳,朱勵;氧化苦參堿抗大鼠肝纖維化及其免疫調(diào)控作用[J];中國臨床醫(yī)學(xué);2004年02期

7 李鵬,司維柯,王源,姚婕;苦參堿與氧化苦參堿抑制HepG2細(xì)胞增殖的對比研究[J];中國生化藥物雜志;2004年05期

8 張靜濤;王偉;段振華;;苦參堿類生物堿的應(yīng)用進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2007年03期

9 寇欣;;微乳給藥系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J];天津藥學(xué);2005年06期

10 安紅麗;歐陽五慶;王俊;申進(jìn)寶;;非離子型表面活性劑微乳的研制[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2007年03期

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