本文關(guān)鍵詞： 仙臺(tái)病毒囊膜 小鼠惡性黑色素瘤 黑色素瘤細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞 凋亡　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：小鼠惡性黑色素瘤(Malignant melanoma, MM)具有惡性程度高、易轉(zhuǎn)移和易復(fù)發(fā)等特點(diǎn),目前常規(guī)療法對(duì)其治療效果不是很好。研究表明,仙臺(tái)病毒囊膜(Hemagglutinating virus of Japan Envelope, HVJ-E)具備強(qiáng)大的抑制或消除腫瘤的功能,且在動(dòng)物腫瘤模型上得到了驗(yàn)證,但目前尚未有直接用HVJ-E治療小鼠黑色素瘤的研究報(bào)道。因此,我們開展用HVJ-E治療小鼠黑色素瘤的研究,旨在初步探討其抗瘤機(jī)制。 首先,通過體外實(shí)驗(yàn)觀察小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16F10)經(jīng)HVJ-E作用后的形態(tài)學(xué)變化,MTT、流式細(xì)胞檢測(cè)、免疫組化、免疫印跡法檢測(cè)經(jīng)HVJ-E作用后的B16F10細(xì)胞的增殖活性、凋亡水平及IGF1R α、β-catenin表達(dá)情況。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)果顯示,PBS陰性對(duì)照組細(xì)胞貼壁良好,呈梭形,生長活躍,折光性好；而HVJ-E處理組細(xì)胞皺縮,破裂,呈不規(guī)則形態(tài),有的細(xì)胞兩端出現(xiàn)細(xì)長的偽足,脫落細(xì)胞增多。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示,不同濃度的HVJ-E對(duì)細(xì)胞都有明顯抑制作用并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,500MOI HVJ-E組在處理72h后與同時(shí)段對(duì)照組相比有顯著差異(p0.05)；1000MOI HVJ-E組在處理72h后與同時(shí)段對(duì)照組相比差異極顯著(p0.01)；隨著HVJ-E處理濃度的增大,B16F10細(xì)胞的凋亡率升高；HVJ-E組的IGF1Rα、β-catenin的表達(dá)明顯低于PBS對(duì)照組,且隨著HVJ-E處理濃度的增大,IGFlRα、β-catenin蛋白表達(dá)量下降。該實(shí)驗(yàn)說明HVJ-E具有直接促使小鼠黑色素瘤細(xì)胞凋亡的作用。 其次,通過體外分離培養(yǎng)小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC),以500MOIHVJ-E病毒樣粒子刺激小鼠骨髓DC,同時(shí)設(shè)PBS陰性對(duì)照與LPS陽性對(duì)照,培養(yǎng)48h后,檢測(cè)各組DC細(xì)胞上清中細(xì)胞因子的分泌水平和DC細(xì)胞表面分子的表達(dá)率。結(jié)果顯示,HVJ-E處理組DC細(xì)胞分泌的IFN-β、IFN-γ水平顯著高于PBS、LPS對(duì)照組(p0.05),IL-6、TNF-α水平顯著高于PBS對(duì)照組(p0.05),但略低于LPS對(duì)照組；HVJ-E處理組的DC細(xì)胞表面分子CD80、CD40、CDllc和MHCⅡ均呈高表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)說明HVJ-E能夠刺激未成熟DC成熟并且分泌細(xì)胞因子從而發(fā)揮抗瘤作用。 最后,通過C57BL/6J小鼠皮內(nèi)接種B16F10細(xì)胞制作小鼠黑色素瘤模型,待瘤體直徑達(dá)0.5cm時(shí),將荷瘤小鼠隨機(jī)分組,每組20只,實(shí)驗(yàn)組小鼠瘤內(nèi)注射HVJ-E病毒樣粒子,同時(shí)設(shè)PBS陰性對(duì)照組,4天之后重復(fù)治療,連續(xù)治療3次,每次治療后測(cè)量腫瘤體積,觀察并分析荷瘤鼠的存活率。另取兩組荷瘤小鼠,每組6只,瘤內(nèi)注射HVJ-E病毒樣粒子,同時(shí)設(shè)PBS陰性對(duì)照,連續(xù)注射3天,最后1次注射后24,48,120h時(shí),每組各處死2只小鼠,分別取瘤組織進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)CD4, CD8, CXCL10, CDllc, IL-2, MITF, IGFIRα, β-catenin mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。治療結(jié)果表明,HVJ-E治療組小鼠的腫瘤體積顯著小于PBS對(duì)照組,且在成瘤后40天內(nèi),HVJ-E治療組小鼠的存活率為80%,而對(duì)照組為0%。熒光定量PCR結(jié)果顯示HVJ-E治療組CD4, CD8, CXCL10, CDllc, IL-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平在24,48,120h時(shí)均高于PBS對(duì)照組,MITF, IGFIRα,β-catenin mRNA轉(zhuǎn)錄水平在24,48h時(shí)均低于PBS對(duì)照組。該實(shí)驗(yàn)說明HVJ-E能激發(fā)機(jī)體的特異性與非特異性細(xì)胞免疫,從而延長黑色素瘤小鼠的生存期。 體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明仙臺(tái)病毒囊膜(HVJ-E)能刺激DC成熟,釋放細(xì)胞因子,并具備潛在的免疫增強(qiáng)效應(yīng)；HVJ-E能直接誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制可能與MITF, IGF1R α和β-catenin的表達(dá)下降有關(guān)；HVJ-E直接進(jìn)行瘤內(nèi)注射后能顯著抑制小鼠惡性黑色素瘤的生長,延長荷瘤小鼠的生存期,其作用機(jī)制不僅僅體現(xiàn)在HVJ-E可誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫的產(chǎn)生,還可能是HVJ-E的致腫瘤細(xì)胞凋亡效應(yīng),但具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。可以肯定的是,HVJ-E可有效減緩腫瘤的生長和延長荷瘤鼠生存期,并有望為黑色素瘤治療提供新的理論依據(jù)和方法。
[Abstract]:The malignant melanoma ( MM ) of mice has the characteristics of high malignancy degree , easy metastasis and easy recurrence . The study shows that Hemaglobating virus of Japan Envelope ( HVJ - E ) has the function of inhibiting or eliminating the tumor and has been verified on animal tumor model . However , it has not been reported directly by HVJ - E in the treatment of mouse melanoma . Therefore , we have carried out the study of treating mouse melanoma with HVJ - E , aiming at initially exploring its anti - tumor mechanism . The expression of IGF1R 偽 , 尾 - catenin in HVJ - E group was significantly lower than that in control group ( P < 0.01 ) . The results showed that the levels of IFN - 尾 and IFN - 緯 were significantly higher in HVJ - E treated group than in PBS , LPS control group ( P < 0.05 ) , IL - 6 and TNF - 偽 were significantly higher than that in PBS control group ( P < 0.05 ) . The results showed that HVJ - E could stimulate immature DC maturation and secrete cytokines to exert anti - tumor effect . The results showed that HVJ - E could stimulate the specific non - specific cell immunity of mice and prolong the survival time of melanoma mice . HVJ - E can significantly inhibit the growth of mouse melanoma cells and prolong the survival of tumor - bearing mice . The mechanism of HVJ - E can significantly inhibit the growth of mouse malignant melanoma and prolong the survival time of tumor - bearing mice .

【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1471351