本文關(guān)鍵詞：microRNA-217對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞衰老的作用及機(jī)制研究　出處：《中南大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 自然衰老 傳代衰老 HSF miR-217 miR-217 HSF 衰老表型 miR-217 DNMT1 熒光素酶報(bào)告基因 HSF 衰老

【摘要】：生物體衰老是一個(gè)包含不同器官和系統(tǒng)的、發(fā)生一系列特定變化的復(fù)雜過程。皮膚衰老是機(jī)體衰老最直接的表現(xiàn),本質(zhì)和基礎(chǔ)是皮膚細(xì)胞的衰老,其不僅受控于遺傳基因的調(diào)節(jié),也受控于表觀遺傳的調(diào)控,后者是衰老發(fā)生的重要機(jī)制,包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑及microRNA (miRNA)調(diào)控等。 miRNA-217是一種已知高表達(dá)于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的miRNA,已被證實(shí)其在胰腺導(dǎo)管腺癌中能通過靶向調(diào)控KRAS起到腫瘤抑制因子的作用,還可靶向調(diào)節(jié)Runx2,從而影響成骨細(xì)胞成熟。在衰老機(jī)制的研究中,已有報(bào)道顯示,miR-217在衰老的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),并可通過抑制長壽基因Sirt1的表達(dá)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的衰老。然而,至目前為止,miR-217對(duì)于皮膚衰老的作用研究還不清楚。本課題組前期通過miRNA芯片發(fā)現(xiàn)傳代衰老組與年青組人皮膚成纖維細(xì)胞(Human skin fibroblasts, HSF)比較,miR-217的表達(dá)量明顯增加。因此,我們推測miR-217可能在HSF衰老中起到了重要作用。 本研究通過三個(gè)部分證實(shí)miR-217在HSF衰老中的作用機(jī)制。第一部分：檢測比較年青組與衰老組HSF中miR-217的表達(dá)。第二部分：研究miR-217在HSF衰老過程中的作用。通過在年青組HSF中過表達(dá)miR-217并檢測細(xì)胞衰老的表型及相關(guān)衰老蛋白的表達(dá),以探討miR-217在細(xì)胞衰老中的作用。第三部分：研究miR-217調(diào)控HSF衰老的機(jī)制：(1)通過生物信息學(xué)預(yù)測,發(fā)現(xiàn)miR-217可能直接靶向DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1),利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證明兩者的直接靶向關(guān)系；(2)在HSF中,檢測miR-217對(duì)DNMT1表達(dá)量的調(diào)節(jié),及其通過DNMT1對(duì)細(xì)胞衰老調(diào)節(jié)的機(jī)制。 通過以上研究揭示miR-217能夠通過下調(diào)DNMT1來促進(jìn)HSF的衰老,為皮膚衰老的研究和治療領(lǐng)域提供新的方向。 第一部分年青組與衰老組人皮膚成纖維細(xì)胞中miR-217的表達(dá)目的：檢測自然衰老與傳代衰老HSF中miR-217的表達(dá)水平。 方法：收取少年組(10歲)、中年組(30～50歲)與老年組(60歲)的正常人避光部位皮膚,原代培養(yǎng)HSF,并將少年組HSF進(jìn)行傳代(年青組：P3-5,衰老組：P20-25),采用Real-time PCR方法檢測miR-217的表達(dá)量。 結(jié)果：和少年組細(xì)胞比較,中年組、老年組HSF中的miR-217表達(dá)量明顯升高(中年組：P0.05,老年組：P0.01),其中老年組較中年組細(xì)胞中miR-217的表達(dá)量也顯著升高(P0.01)。和年青組細(xì)胞比較,傳代衰老組細(xì)胞的miR-217的表達(dá)量亦明顯升高(P0.01)。 結(jié)論：自然衰老與傳代衰老的HSF中miR-217的表達(dá)明顯上升。 第二部分miRNA-217對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞衰老的作用 目的：研究miR-217在HSF衰老過程中的作用。 方法：在年青組HSF中,通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hsa-miR-217的慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒,48小時(shí)后,采用Real-time PCR方法檢測miR-217的表達(dá)量,MTT法檢測HSF細(xì)胞增殖能力,衰老β-半乳糖苷酶染色法檢測HSF的衰老相關(guān)染色率,western blot法檢測衰老相關(guān)蛋白P53、P21、sirt1等的改變。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染hsa-miR-217的慢病毒后,HSF中的miR-217表達(dá)量顯著上調(diào)(P0.01),細(xì)胞增殖能力明顯下調(diào)(P0.05),衰老β-半乳糖苷酶染色率明顯上升(P0.01),衰老相關(guān)蛋白P53、P21的表達(dá)量上升、sirt1表達(dá)量下降(P0.05)。 結(jié)論：過表達(dá)miR-217可明顯促進(jìn)HSF的衰老,miR-217在HSF的衰老過程中起到重要作用。 第三部分miRNA-217直接調(diào)控HSF中DNMT1的表達(dá)及機(jī)制 目的：研究miR-217在HSF衰老過程中的調(diào)控機(jī)制。 方法：通過MICRORNA.ORG網(wǎng)站預(yù)測DNMT1是否為hsa-miR-217可能的直接靶向基因,并構(gòu)建DNMT1的3'UTR區(qū)域的野生型與突變型的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,在293T細(xì)胞中,分別轉(zhuǎn)染野生型與突變性DNMT1-3'UTR質(zhì)粒,4小時(shí)后將miR-217化學(xué)模擬物(mimics)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,48小時(shí)后溶解細(xì)胞,熒光素酶檢測系統(tǒng)分析熒光強(qiáng)度。構(gòu)建含DNMT1shRNA序列的慢病毒載體,通過在年青組HSF中抑制DNMT1的表達(dá)量來檢測HSF的衰老表型。利用第二部分中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的年青組HSF,提取細(xì)胞總蛋白,利用western blot法檢測DNMT1的蛋白表達(dá)量,并在過表達(dá)miR-217的年青組HSF中,轉(zhuǎn)染DNMT1-cDNA質(zhì)粒,衰老β-半乳糖苷酶染色法檢測HSF的衰老相關(guān)染色率。 結(jié)果：MICRORNA.ORG網(wǎng)站預(yù)測到miR-217的3'UTR區(qū)域可以直接靶向DNMT1的序列。熒光素酶報(bào)告基因檢測顯示,野生型的DNMT1-3'UTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,過表達(dá)miR-217后,熒光量較未過表達(dá)組下降(P0.05),而突變型的DNMT1-3'UTR轉(zhuǎn)染組未發(fā)生明顯變化。年青組HSF中抑制DNMT1的表達(dá)量后,細(xì)胞增殖能力明顯減弱(P0.05),衰老β-半乳糖苷酶染色率明顯上升(P0.01)；年青組HSF中過表達(dá)miR-217后,DNMT1的蛋白表達(dá)量明顯下降(P0.01)；同時(shí)轉(zhuǎn)染含hsa-miR-217shRNA和DNMT1-shRNA序列的慢病毒載體后,較單獨(dú)下調(diào)hsa-miR-217組,衰老β-半乳糖苷酶染色率上升(P0.05)。 結(jié)論：DNMT1是miR-217的調(diào)控的靶基因,miR-217可直接靶向結(jié)合DNMT1的3'UTR區(qū)；傳代衰老的HSF中DNMT1表達(dá)量明顯下降,抑制DNMT1的表達(dá)量后,可以明顯促進(jìn)HSF的衰老；miR-217通過抑制DNMT1的表達(dá)量從而促進(jìn)HSF的衰老。
[Abstract]:Biological aging is a complex process that contains different organs and systems and has a series of specific changes. Skin aging is the most direct manifestation of aging, is the essence and basis of the aging of skin cells, the regulation is not only controlled by genes, also controlled by epigenetic regulation, which is an important mechanism of aging, including DNA methylation, histone modification, chromatin remodeling and the regulation of microRNA (miRNA).
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R751

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉萃萃;王璐璐;趙衛(wèi)衛(wèi);彭攸;王玉平;孫振亮;馮景;;miRNAs慢病毒文庫篩選靶向EZH23'非翻譯區(qū)的新型miRNAs及其在乳腺癌中的表達(dá)[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2014年03期

，

本文編號(hào)：1343232