本文關(guān)鍵詞：HPV相關(guān)miRNA參與HPV免疫逃逸的分子機(jī)制及基于miRNA骨架的RNA干擾載體的效應(yīng)研究　出處：《浙江大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景與目的 尖銳濕疣(Condyloma acuminatum,CA)是臨床上最常見的性傳播性疾病之一,具有潛伏期長、反復(fù)發(fā)作、治療遷延的特點(diǎn),嚴(yán)重危害了患者的身心健康、家庭幸福和社會(huì)安定,也為性傳播性疾病的防控帶來棘手難題。因此,針對HPV感染的免疫逃逸機(jī)制進(jìn)行研究,探尋理想靶標(biāo)進(jìn)行復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評估,進(jìn)而研制有效的治療性藥物以減少CA的反復(fù)發(fā)作具有重要意義。 研究證明HPV在親嗜上皮細(xì)胞后實(shí)現(xiàn)長期潛伏而導(dǎo)致感染遷延難愈的主要原因是：HPV入侵宿主細(xì)胞后,一方面通過干擾信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子的形成導(dǎo)致干擾素產(chǎn)生及活化的下調(diào),以及下調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)包括前炎癥因子、趨化因子等的細(xì)胞因子反應(yīng)；另一方面亦可通過干擾角質(zhì)形成細(xì)胞的抗原遞呈及CD8+CTL的活化從而導(dǎo)致宿主不能啟動(dòng)有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答。近年來越來越多的研究表明,miRNA在基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮廣泛而重要的作用,尋找miRNA分子及其靶基因的研究正成為基因調(diào)控領(lǐng)域的重要分支和熱點(diǎn)。然而miRNA分子是否也參與了HPV感染細(xì)胞免疫逃逸的調(diào)控,目前仍然不清楚。 由Pol-II RNA酶轉(zhuǎn)錄和剪切產(chǎn)生的miRNA是被高度調(diào)控的,模擬miRNA的框架結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)shRNA可實(shí)現(xiàn)特異性靶向腫瘤或組織的基因沉默,且合理設(shè)計(jì)的PolⅡ啟動(dòng)子調(diào)控的miR-shRNA的基因沉默效率可顯著高于Pol III啟動(dòng)子所調(diào)控的shRNA. 本課題第一部分篩選和鑒定出參與調(diào)控HPV免疫逃逸的miRNA分子,通過miRNA功能獲得和缺失實(shí)驗(yàn),觀察目標(biāo)miRNA時(shí)序性變化在體內(nèi)外多個(gè)HPV感染模型中引起的免疫逃逸相關(guān)通路上目標(biāo)靶基因表達(dá)及下游效應(yīng)的改變,并通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,旨在揭示miRNA在HPV感染免疫逃逸調(diào)控中的作用、機(jī)制和主要調(diào)控靶點(diǎn)。為發(fā)現(xiàn)阻斷CA反復(fù)發(fā)生的新靶點(diǎn)及開發(fā)CA miRNA治療藥物提供科學(xué)依據(jù)。 本課題第二部分構(gòu)建了基于miR-30骨架的RNAi載體,并觀察和比較其效應(yīng)和安全性,旨在研究和探尋更為理想的治療性RNAi載體,拓展抗病毒和抗腫瘤治療的新思路。 研究方法 1.臨床研究 收集5例HPV-6b陽性的男性CA樣本及其HPV陰性的自身對照包皮,通過miRNA芯片篩查miRNA的差異表達(dá)。擴(kuò)大樣本收集60例CA患者皮損和20例健康對照者包皮,熒光定量PCR法驗(yàn)證CA皮損中miRNA的差異表達(dá),并與臨床性征進(jìn)行相關(guān)性分析。利用生物信息學(xué)技術(shù)構(gòu)建差異表達(dá)miRNA-靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 2.miR-31的模擬物和抑制物的構(gòu)建及其功能和調(diào)控靶基因的確定和驗(yàn)證 構(gòu)建pre-miR-31模擬物和niR-31抑制物的慢病毒載體,分別作用HeLa細(xì)胞、SiHa細(xì)胞以及HaCaT細(xì)胞,觀察miR-31對細(xì)胞增殖和凋亡的影響；并用Poly(I:C)刺激各組細(xì)胞,以ELISA檢測各組細(xì)胞上清中炎癥性細(xì)胞因子、Ⅰ型或Ⅱ型干擾素和趨化因子表達(dá)的變化；利用基因芯片技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果,篩選出miR-31可能調(diào)控的下游靶基因,以熒光定量PCR進(jìn)行篩選,并以熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,確定出調(diào)控靶基因。 3.構(gòu)建基于miR-30骨架的RNAi載體并進(jìn)行效應(yīng)評價(jià) 設(shè)計(jì)3條基于miR-30骨架的和普通構(gòu)型的HPSE-shRNA,利用基因重組技術(shù)包裝出LV PP-GFP/HPSE-miRNAs和LV pGCSIL-GFP/HPSE-shRNAs'慢病毒。在體外通過熒光定量PCR法和westemblot法比較LV PP-GFP/HPSE-miRNAs和LVpGCSIL-GFP/HPSE-shRNAs對HPSE基因和蛋白表達(dá)的干擾效果,以細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)比較兩者對黑素瘤A375細(xì)胞粘附、遷移和侵襲能力的影響。在裸鼠動(dòng)物模型上觀察和比較LV PP-GFP/HPSE-miRNA和LV pGCSIL-GFP/HPSE-shRNA對皮下成瘤、黑素瘤體內(nèi)轉(zhuǎn)移及毒副作用的比較。 研究結(jié)果 1.CA樣本中miRNA的差異表達(dá) (1) miRNA芯片結(jié)果中,實(shí)驗(yàn)樣本和對照樣本表達(dá)上調(diào)或下調(diào)4倍以上且陽性信號反應(yīng)值500的miRNA作為差異表達(dá)miRNA,其中以miR-31表達(dá)增高最為顯著。 (2)熒光定量PCR擴(kuò)大驗(yàn)證結(jié)果中除了miR-195和miR-30b表達(dá)無明顯差異外,其余miRNA均有差異表達(dá),其中miR-31表達(dá)增高最為顯著。miR-31的表達(dá)與發(fā)作次數(shù)和病程密切相關(guān),且與病程呈正相關(guān)。 (3)構(gòu)建出CA差異表達(dá)miRNA-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。 2.miR-31對HPV感染細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞因子表達(dá)的影響,及其調(diào)控靶基因的篩選和驗(yàn)證 (1)成功構(gòu)建了表達(dá)pre-miR-31模擬物和miR-31抑制物的重組慢病毒。建立了穩(wěn)定感染并表達(dá)pre-miR-31模擬物和抑制物的HeLa細(xì)胞、SiHa細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞。 (2)MTT結(jié)果顯示穩(wěn)定表達(dá)miR-31模擬物和抑制物的HeLa細(xì)胞、SiHa細(xì)胞組間細(xì)胞增殖和活力無顯著差異(P0.05),時(shí)序性miR-31差異表達(dá)組間細(xì)胞增殖無明顯差異(P≥0.05)。Annexcin-V-PE凋亡檢測結(jié)果顯示穩(wěn)定表達(dá)miR-31模擬物和抑制物的HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞組間凋亡細(xì)胞比例無顯著差異(P≥0.05)。 (3)ELISA結(jié)果顯示,在poly (I:C)的協(xié)同刺激下,miR-31抑制物能夠促進(jìn)HeLa和SiHa細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子IL-1p和IL-6、趨化因子IL-8、CXCL-1和RANTES以及Ⅰ型干擾素IFN-a和IFN-β(P0.05);能夠促進(jìn)HaCaT細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子IL-1p和IL-6、趨化因子IL-8、CXCL-1和RANTES以及Ⅰ型干擾素IFN-β和Ⅱ型干擾素IFN-γ(P0.05)。 (4)根據(jù)差異表達(dá)miR-31的HeLa細(xì)胞組間基因差異表達(dá)譜的結(jié)果,結(jié)合軟件預(yù)測結(jié)果篩選出miR-31可能調(diào)控的下游靶基因一-MAP3K1、MAP3K14、MAP4K5、 HLA-A、IRF1和PKC等,差異基因位于MAPK/NFκB信號通路上。熒光定量PCR檢測及westernblot實(shí)驗(yàn)證實(shí)差異表達(dá)miR-31組間MAP3K1的表達(dá)有顯著差異(P0.05)。 (5)成功構(gòu)建出MAP3K13'UTR野生型和突變型載體。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示miR-31模擬物對野生型載體中的報(bào)告熒光有明顯的下調(diào)作用；對其預(yù)測靶位點(diǎn)進(jìn)行突變后,突變型載體中的報(bào)告熒光有所恢復(fù)(P0.05)。 3.基于miR-30骨架的RNAi載體的構(gòu)建及效應(yīng)比較 (1)成功構(gòu)建出基于miR-30骨架的靶向HPSE的RNAi載體LV PP-GFP/HPSE-miRNAs'慢病毒,以及常規(guī)構(gòu)型的LV pGCSIL-GFP/HPSE-shRNAs'慢病毒。 (2)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對照和各自的陰性對照比較,MOI=10時(shí)各LVPP-GFP/HPSE-miRNAs組和LV pGCSIL/HPSE-shRNAs組HPSE表達(dá)下調(diào)有顯著差異,并在體外能夠抑制A375細(xì)胞的增殖、粘附、遷移和侵襲能力(P0.05)。但LV PP-GFP/HPSE-miRNA和LV pGCSIL/HPSE-shRNA組間比較無顯著差異)(P≥_0.05)。 (3)體內(nèi)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對照和各自的陰性對照比較,LVPP-GFP/HPSE-miRNA組和LV pGCSIL/HPSE-shRNA組皮下腫瘤的體積、肺臟轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目明顯減少(P0.05),但兩組間比較無顯著差異(P≥0.05)。但LV PP-GFP/miRNA組引起肝臟炎癥灶、肺臟水腫和炎癥灶的數(shù)量和程度較LV pGCSIL/shRNA組明顯減輕(P0.05)。 研究結(jié)論 (1)CA組織中有多個(gè)有意義的差異表達(dá)的miRNA分子,其中以miR-31表達(dá)增高最為顯著。 (2)miR-31在HPV感染細(xì)胞中不參與細(xì)胞增殖和凋亡,其抑制物上調(diào)細(xì)胞前炎癥因子、趨化因子和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生；其調(diào)控機(jī)制與miR-31下調(diào)MAPK/NFκB信號通路中的MAP3K1有關(guān)。 (3)基于miRNA骨架的RNAi載體能夠有效下調(diào)靶基因的表達(dá),且引起更少的肺臟和肝臟的毒副作用。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R752.53

【參考文獻(xiàn)】

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1 鄭駿年;毛立軍;溫儒民;劉俊杰;李望;薛松;孫曉青;韓瑞發(fā);馬騰驤;;增殖及非增殖腺病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾對腎癌細(xì)胞殺傷作用[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2007年07期

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本文編號：1337303