本文關(guān)鍵詞：miR-377通過抑制DNMT1促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞衰老

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【摘要】：目的： 研究miR-377調(diào)節(jié)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase1)的表達(dá)在人皮膚成纖維(Human skin fibroblasts, HSF)衰老中的作用及機(jī)制。 方法： 1.構(gòu)建皮膚成纖維細(xì)胞復(fù)制性衰老模型(n=8)(年青組：p3-5,年老組：p25-30),免疫印跡法(Western-Blot)檢測人皮膚成纖維細(xì)胞傳代衰老模型中DNMT、Sirtl等蛋白的表達(dá),并檢測衰老相關(guān)p-半乳糖苷酶的活性。 2.利用DNMT1siRNA抑制人皮膚成纖維細(xì)胞中DNMT1的表達(dá),免疫印跡法(Western-Blot)檢測DNMT1、Sirtl等指標(biāo)的改變,檢測衰老相關(guān)p-半乳糖苷酶的活性。 3.生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測可能與DNMT1的3’UTR區(qū)域結(jié)合并調(diào)控DNMT1的miRNA,初步確定為miR-377能與DNMT1的3’UTR區(qū)域結(jié)合,可能調(diào)控DNMT1的表達(dá)。 4.使用實(shí)時(shí)定量PCR (Real-Time PCR)法檢測人皮膚成纖維細(xì)胞復(fù)制性衰老模型中miR-377的表達(dá)。 5.構(gòu)建miR-377的過表達(dá)病毒載體及抑制慢病毒載體,使用免疫印跡法(Western-Blot)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞DNMT1, Sirtl等蛋白的表達(dá),檢測細(xì)胞中p-半乳糖苷酶的活性。 6.構(gòu)建DNMT1的3'UTR上miR-377的結(jié)合位點(diǎn)序列(野生型)及其突變序列的熒光素酶報(bào)告基因重組載體。以探討miR-377對DNMT1表達(dá)的影響。 7.收集不同年齡避光部位的皮膚,在體內(nèi)表皮自然衰老模型、成纖維細(xì)胞自然衰老模型中驗(yàn)證miR-377及DNMT1的表達(dá)。 結(jié)果： 1.人皮膚成纖維細(xì)胞復(fù)制性衰老模型中,衰老組與年輕組相比,p-半乳糖苷酶染色率升高(p0.001)、Sirt1的表達(dá)顯著下降(p0.05),說明我們的復(fù)制性衰老模型構(gòu)建成功；DNMT1含量在衰老組的表達(dá)明顯低于年青組(p0.05)。 2.DNMT1siRNA能顯著抑制DNMT1的表達(dá)(p0.05), siRNA處理組與陰性對照組及空白組相比p-半乳糖苷酶染色率明顯升高(p 0.01), Sirt1的表達(dá)顯著下降(p0.05), DNMT1沉默能使細(xì)胞出現(xiàn)衰老表型。 3.在人皮膚成纖維細(xì)胞復(fù)制性衰老模型中,miR-377在衰老組的表達(dá)明顯高于年輕組(p0.05)。 4.年輕皮膚成纖維細(xì)胞中過表達(dá)miR-377可使細(xì)胞中p-半乳糖苷酶染色率升高(p0.05), Sirt1表達(dá)下降(p0.05),較空白對照組、陰性對照有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在衰老皮膚成纖維細(xì)胞中抑制miR-377表達(dá)可使p-半乳糖苷酶染色率降低(p0.05), Sirtl的表達(dá)升高(p0.05),較空白對照組、陰性對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5、年輕皮膚成纖維細(xì)胞中過表達(dá)miR-377, miR-377過表達(dá)組中DNMT1的表達(dá)較空白對照組、陰性對照組明顯降低(p0.05)。而在衰老細(xì)胞中抑制miR-377的表達(dá),miR-377抑制組中DNMT1的表達(dá)較空白對照組、陰性對照組明顯升高(p0.05)。 6.熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-377與DNMT13'UTR區(qū)域存在直接相互作用,miR-377能夠調(diào)節(jié)DNMT1的表達(dá)。 7.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明,miR-377在衰老皮膚組織表達(dá)明顯升高(p0.05),DNMT1的表達(dá)隨年齡增加逐步下降(p0.05)。 結(jié)論： 1.DNMT1在皮膚衰老過程中起重要作用。 2.miR-377可以通過直接靶向DNMT13'UTR區(qū),調(diào)節(jié)DNMT1的表達(dá),從而在皮膚成纖維細(xì)胞衰老中起重要作用。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R751

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1291657