本文關(guān)鍵詞：組蛋白低乙�；抡{(diào)PIB5PA表達(dá)在人黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制

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【摘要】：研究背景及目的黑色素瘤是來(lái)源于神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞的一種最致命的皮膚惡性腫瘤。由于其惡性程度極高，且易于早期轉(zhuǎn)移，患者臨床發(fā)現(xiàn)時(shí)已喪失手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，而且放化療效果普遍不佳，導(dǎo)致其治療難度大。因此，深入了解黑色素瘤的發(fā)病機(jī)理和耐藥機(jī)制，以尋求針對(duì)特異性分子靶點(diǎn)的個(gè)體化治療成為目前黑色素瘤治療的熱點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號(hào)通路在70%黑色素瘤中被高度激活，這可能導(dǎo)致了黑色素瘤對(duì)化療和一些分子靶向治療如BRAFV600E抑制劑的抵抗。而對(duì)于能夠負(fù)向調(diào)控該信號(hào)通路的多磷酸肌醇-3-磷酸酶PTEN的缺失正是導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)通路在黑色素瘤中高活化的重要原因之一。然而對(duì)于與PTEN類(lèi)似的具有脂質(zhì)磷酸酶活性的多磷酸肌醇-5-磷酸酶在黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。本研究旨在通過(guò)鑒定一種多磷酸肌醇-5-磷酸酶分子-PIB5PA在黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用并闡明其負(fù)向調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)的分子機(jī)制，為黑色素瘤的個(gè)體化治療提供一個(gè)新的分子靶點(diǎn)，另外通過(guò)對(duì)PIB5PA在黑色素瘤細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制的探索，不僅為研究黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新的思路，同時(shí)對(duì)下調(diào)PIB5PA表達(dá)的HDAC的鑒定將有益于發(fā)展更特異的HDAC抑制劑抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)。 方法（1）分別采用免疫組化法、Western blot以及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)黑色素瘤組織芯片、新鮮黑色素瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞以及黑色素瘤細(xì)胞系中PIB5PA, PTEN以及磷酸化Akt的表達(dá)水平。（2）選擇兩株極低表達(dá)PIB5PA以及Akt高活化的黑色素瘤細(xì)胞系ME1007和Mel-FH瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PIB5PA cDNA以及建立攜帶可誘導(dǎo)表達(dá)PIB5PA基因系統(tǒng)的黑色素瘤亞細(xì)胞系（ME1007.PIB5PA和Mel-FH.PIB5PA），采用Western blot檢測(cè)PIB5PA和磷酸化Akt的表達(dá)，BrdU細(xì)胞增殖試驗(yàn)和克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；通過(guò)在正常人黑色素細(xì)胞中knockdown PIB5PA以及PTEN，利用軟瓊脂克隆試驗(yàn)檢測(cè)黑色素細(xì)胞非貼附性生長(zhǎng)情況；通過(guò)建立ME1007.PIB5PA細(xì)胞的裸鼠荷瘤模型，觀察4-OHT誘導(dǎo)PIB5PA表達(dá)對(duì)體內(nèi)黑色素瘤生長(zhǎng)的影響，明確PIB5PA在黑色素瘤生長(zhǎng)中的作用；在此基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)或knockdown PIB5PA的細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染myr-Akt或Akt shRNA，檢測(cè)其對(duì)PIB5PA抑制細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)的逆轉(zhuǎn)效果，明確PIB5PA抑制黑色素瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制。（3）通過(guò)對(duì)PIB5PA和PTEN基因的單獨(dú)或雙重轉(zhuǎn)染，在血清饑餓狀態(tài)下加以EGF誘導(dǎo)，利用Western blot檢測(cè)黑色素瘤細(xì)胞中Akt活化水平的改變，以及同時(shí)沉默PIB5PA和PTEN基因，利用軟瓊脂克隆試驗(yàn)檢測(cè)正常黑色素細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，以了解PIB5PA和PTEN在調(diào)節(jié)黑色素瘤細(xì)胞PI3K/Akt通路中的作用關(guān)系。（4）通過(guò)對(duì)10株黑色素瘤細(xì)胞系PIB5PA基因外顯子的測(cè)序，實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)黑色素瘤細(xì)胞PIB5PA基因拷貝數(shù)進(jìn)行分析，Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)DNA甲基化抑制劑5-aza以及不同特異性的HDAC抑制劑分別作用黑色素瘤細(xì)胞前后PIB5PA的表達(dá)水平，初步明確PIB5PA在黑色素瘤下調(diào)表達(dá)的原因；通過(guò)對(duì)特異性HDAC的siRNA knockdown，，利用western blot檢測(cè)PIB5PA表達(dá)水平的變化確定黑色素瘤細(xì)胞中下調(diào)PIB5PA表達(dá)的HDAC；通過(guò)對(duì)PIB5PA基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行遞增式刪除構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)和染色質(zhì)免疫沉淀試驗(yàn)明確HDAC通過(guò)SP1結(jié)合于PIB5PA啟動(dòng)子區(qū)從而影響PIB5PA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的分子機(jī)制。 結(jié)果（1）與正常痣組織和黑色素細(xì)胞相比，在黑色素瘤病理組織以及黑色素瘤細(xì)胞中PIB5PA的表達(dá)是明顯降低或缺失的，且與PTEN的表達(dá)呈一定的正關(guān)聯(lián)。（2）在黑色素瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PIB5PA能降低Akt的活化，抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖，而共轉(zhuǎn)染myr-Akt能逆轉(zhuǎn)其抑制作用；在正常黑色素細(xì)胞中knockdownPIB5PA能抑制Akt的活化，促進(jìn)黑色素細(xì)胞的非貼附性生長(zhǎng)，而共轉(zhuǎn)染Akt shRNA卻能逆轉(zhuǎn)其促進(jìn)作用；外源性誘導(dǎo)PIB5PA在裸鼠荷瘤試驗(yàn)中抑制腫瘤的生長(zhǎng)，而對(duì)ME1007.PIB5PA細(xì)胞感染myr-Akt慢病毒顆粒后能逆轉(zhuǎn)PIB5PA對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。（3）撤除血清后，過(guò)表達(dá)PIB5PA能在EGF刺激下引起Akt磷酸化水平的一過(guò)性增高，而過(guò)表達(dá)PTEN僅顯示磷酸化Akt的整體水平的降低；在EGF刺激下，對(duì)黑色素瘤細(xì)胞同時(shí)過(guò)表達(dá)PIB5PA和PTEN能進(jìn)一步降低Akt的活化水平，而同時(shí)在兩株相對(duì)高表達(dá)PIB5PA的黑色素瘤細(xì)胞中同時(shí)knockdown PIB5PA和PTEN則引起Akt的進(jìn)一步激活；相對(duì)于在正常黑色素細(xì)胞中僅knockdownPIB5PA或PTEN，雙重knockdown PIB5PA和PTEN形成的細(xì)胞克隆的體積明顯增大，而細(xì)胞克隆數(shù)卻有所減少。（4）盡管基因拷貝數(shù)降低可能造成一部分黑色素瘤細(xì)胞（20%）中PIB5PA的低表達(dá)，但是由HDAC2和-3引起的組蛋白低乙�；窃斐珊谏亓黾�(xì)胞中PIB5PA下調(diào)表達(dá)的一個(gè)重要因素。HDAC2和-3能通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子SP1作用于PIB5PA啟動(dòng)子區(qū)（-516/-116）進(jìn)而抑制PIB5PA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 結(jié)論P(yáng)IB5PA的下調(diào)表達(dá)所引起的黑色素瘤中PI3K/Akt信號(hào)通路被激活，以及與PTEN的協(xié)同作用，可能是造成黑色素瘤發(fā)生發(fā)展以及對(duì)化療產(chǎn)生抵抗的一個(gè)重要因素。組蛋白低乙�；种屏薖IB5PA在黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)，其主要機(jī)制在于HDAC2和-3與轉(zhuǎn)錄因子Sp1形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體結(jié)合于PIB5PA啟動(dòng)子參與了對(duì)PIB5PA基因轉(zhuǎn)錄活性的負(fù)向調(diào)節(jié)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R739.5

【共引文獻(xiàn)】

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