本文關(guān)鍵詞：結(jié)合fH對(duì)淋病候選疫苗NspA免疫活性的影響

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【摘要】：淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)引起的淋病是最常見(jiàn)的性病之一,對(duì)人類健康造成極大危害。淋病奈瑟菌可重復(fù)感染,并大大增加HIV的感染機(jī)會(huì)。耐藥菌株的不斷出現(xiàn)使淋病的治療面臨很大困境。因此,研制有效疫苗成為淋病防治的一個(gè)研究熱點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)室前期研究提示表面蛋白A(Neisseria surface protein A,NspA)在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生具有淋病奈瑟菌特異性殺菌作用的抗體,可作為一種淋病候選疫苗。腦膜炎奈瑟菌NspA可結(jié)合人補(bǔ)體調(diào)控蛋白H因子(factor H, fH),而腦膜炎奈瑟菌強(qiáng)力候選疫苗H因子結(jié)合蛋白(factor H-binding protein, fHBP)結(jié)合fH后降低了免疫原性及其誘生抗體的殺菌作用。考慮到淋病奈瑟菌與腦膜炎奈瑟菌的NspA有95%的同源性,我們認(rèn)為淋病奈瑟菌NspA也可能結(jié)合fH。為研究淋病奈瑟菌NspA與fH的結(jié)合性以及結(jié)合fH對(duì)NspA的免疫原性和抗體保護(hù)性的影響,本文進(jìn)行了以下研究。 1. fHSCR5-8的原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備 fH與NspA的結(jié)合位點(diǎn)位于SCR(short consensus repeat)6-7,因此,本研究根據(jù)發(fā)表的fHcDNA序列設(shè)計(jì)了正反向引物,以Dan M. Granoff教授饋贈(zèng)的pCAGGS-fH質(zhì)粒為模板用PCR技術(shù)克隆了fH SCR5-8的編碼基因,并構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體pCold-fHSCR5-8。序列分析結(jié)果表明克隆的fH SCR5-8編碼基因與GeneBank發(fā)表的相應(yīng)序列同源性為100%。在BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了76kDa的His-TF-fH SCR5-8融合蛋白。重組蛋白經(jīng)Bio-Rad蛋白純化儀純化后純度為93%。用pCAGGS-fH真核表達(dá)載體免疫小鼠,制備了fH多克隆抗體,ELISA檢測(cè)表明抗體的效價(jià)在1：6400-1：12800之間。Western-blotting結(jié)果表明rfH SCR5-8能與基因免疫抗體結(jié)合,具有良好的抗原性。 2.NspA的原核表達(dá)及淋病奈瑟菌WHO-A株多克隆抗體的制備 為研究NspA能否與fH結(jié)合,以含pVAX1-NspA的重組菌為模板,用PCR技術(shù)克隆了NspA的編碼基因,與pCold-TF載體連接后,構(gòu)建了NspA原核表達(dá)載體pCold-NspA,轉(zhuǎn)化BL21(DE3)后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了68kDa的His-TF-NspA融合蛋白。用Bio-Rad蛋白純化儀純化的重組蛋白純度為95%。為制備可結(jié)合NspA的抗體,用淋病奈瑟菌WHO-A株免疫小鼠,ELISA檢測(cè)表明免疫血清的效價(jià)在1：1600-1：3200之間。Western-blotting分析表明rNspA能與WHOA株多克隆抗體結(jié)合。 3.淋病奈瑟菌NspA與fH SCR5-8的結(jié)合性分析 淋病奈瑟菌WHO-A株與rfH SCR5-8及fH基因免疫血清孵育后用流式細(xì)胞儀檢測(cè),結(jié)果表明WHO-A株能與rfH SCR5-8結(jié)合,提示W(wǎng)HO-A株表面有一種或多種物質(zhì)可結(jié)合rfH SCR5-8。將rNspA轉(zhuǎn)印PVDF膜,與rfH SCR5-8及fH基因免疫血清孵育后在68kDa左右處檢測(cè)到明顯反應(yīng)條帶,提示rNspA可與fH SCR5-8結(jié)合。在96孔板中包被rNspA, ELISA檢測(cè)也提示了rNspA與rfH SCR5-8的結(jié)合。 將fH SCR5-8編碼基因插入pEGFP-N1真核表達(dá)載體,獲得的重組載體pEGFP-fHSCR5-8轉(zhuǎn)染CT-26細(xì)胞,G418篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)重組蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。提取重組細(xì)胞的總蛋白,轉(zhuǎn)印PVDF膜,與rNspA及WHO-A抗體孵育后在76kDa處可檢測(cè)到明顯反應(yīng)條帶,驗(yàn)證了fH SCR5-8與NspA的結(jié)合。 4.結(jié)合fH對(duì)NspA候選疫苗免疫效應(yīng)的影響 為研究結(jié)合fH后對(duì)NspA候選疫苗免疫效應(yīng)的影響,將rNspA和rNspA-rfH的復(fù)合體分別免疫小鼠,ELISA檢測(cè)表明rNspA免疫組抗體效價(jià)與rNspA-rfH SCR5-8復(fù)合體免疫組的抗體效價(jià)無(wú)明顯差異,抗體與淋病奈瑟菌的結(jié)合能力降低�？贵w介導(dǎo)補(bǔ)體殺菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,rNspA-rfH SCR5-8復(fù)合體免疫組殺菌活性降低。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R759.2;R392

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

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本文編號(hào)：1285973