本文關(guān)鍵詞：梅毒血清固定患者的治療及其外周血單個(gè)核細(xì)胞microRNAs表達(dá)譜的研究

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【摘要】：研究背景和目的梅毒血清固定是指部分患者經(jīng)過(guò)正規(guī)驅(qū)梅方案治療后,其快速血漿血清反應(yīng)素(Rapid plasma region test, RPR)滴度下降至一定水平后不再變化并長(zhǎng)期維持低滴度,即稱為血清固定。在臨床工作中,我們經(jīng)常會(huì)給予梅毒血清固定患者經(jīng)驗(yàn)性的芐星青霉素治療。然而,關(guān)于芐星青霉素對(duì)梅毒血清固定患者療效的系統(tǒng)研究相對(duì)較少。此外,梅毒血清固定的發(fā)病機(jī)制一直不清楚,有學(xué)者認(rèn)為與機(jī)體免疫功能密切相關(guān),其中microRNA可能發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。MicroRNA是一類長(zhǎng)度約為21bp的非編碼負(fù)性調(diào)控RNA分子,參與眾多重要生理和病理途徑,包括炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)、凋亡、并在宿主抗感染免疫應(yīng)答中發(fā)揮不可替代的調(diào)節(jié)作用。病原體能夠利用nicroRNA進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,以利于微生物在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和免疫逃逸。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)microRNA在結(jié)核分枝桿菌、幽門螺旋桿菌等感染性疾病的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中扮演著重要的角色,但是有關(guān)梅毒螺旋體的研究尚屬空白。因此本課題首先從臨床角度探討芐星青霉素治療梅毒血清固定患者的療效。其次,從功能基因組學(xué)角度出發(fā),運(yùn)用Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)二期梅毒和梅毒血清固定患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC) microRNA進(jìn)行研究,篩選鑒定出特異表達(dá)microRNA,并通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)研究其與靶基因及相關(guān)調(diào)控途徑,為揭示梅毒血清固定的發(fā)病機(jī)制提供有價(jià)值的研究思路。研究對(duì)象1.療效評(píng)價(jià)：從2001年1月—2013年1月期間我院皮膚性病中心有病歷記載的697例晚期潛伏梅毒和971例不明病期潛伏梅毒患者中,選擇有完整隨訪記錄的70例梅毒血清固定患者資料進(jìn)行回顧性分析,其中芐星青霉素復(fù)治組的患者35例,無(wú)任何治療組患者35例。兩組平均年齡均為30歲,性別比例無(wú)顯著性差異。2. microRNA表達(dá)譜的研究：選取2013年6月—2014年6月期間就診于我院皮膚性病中心并經(jīng)血清學(xué)檢測(cè)確診的28例二期梅毒、27例梅毒血清固定患者。同期收集40例健康志愿者作為對(duì)照組。三組間性別、年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究方法1.回顧性分析我院性病中心2001年1月—2013年1月期間的有完整隨訪記錄的70例梅毒血清固定患者,將其分為芐星青霉素治療組(n=35)和對(duì)照組(n=35)。治療組患者予芐星青霉素240萬(wàn)單位肌注,每周1次,一共3次進(jìn)行復(fù)治。對(duì)照組患者未予任何治療。復(fù)治12個(gè)月后復(fù)查RPR滴度以觀療效。以RPR下降≥2個(gè)滴度為有效,RPR下降2個(gè)滴度為無(wú)效判定結(jié)果。2.選取2013年6月—2014年6月期間在我院皮膚科性病中心診斷的二期梅毒、血清固定患者各5例,并收集5例健康志愿者作為對(duì)照組,采用新一代高通量測(cè)序技術(shù)Illumina HiSeq法對(duì)15例患者的PBMC樣本進(jìn)行microRNA深度測(cè)序研究,分析差異性表達(dá)的基因,擴(kuò)大樣本量,收集23例二期梅毒患者、22例梅毒血清固定患者和35例健康志愿者PBMC樣本,對(duì)顯著差異表達(dá)的microRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real time-PCR, RT-PCR)驗(yàn)證。利用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)、Gene Ontology (GO)和KEGG功能注釋等分析。結(jié)果1.芐星青霉素治療組中有26例患者治療有效,9例患者治療無(wú)效,仍保持血清固定,有效率為74.2%；無(wú)任何治療的對(duì)照組中有28例患者治療有效,7例患者治療無(wú)效,有效率為80%,兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.所有15個(gè)樣品均建庫(kù)成功,并采用Illumina HiSeq高通量測(cè)序。二期梅毒、血清固定患者和正常對(duì)照組三組間所測(cè)的microRNAs表達(dá)水平兩兩對(duì)比后,(1)以Rati1和P0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)二期梅毒與正常對(duì)照組間表達(dá)差異表達(dá)的microRNAs有146個(gè),其中54個(gè)上調(diào),92個(gè)下調(diào)；血清固定組與正常對(duì)照組間表達(dá)差異表達(dá)microRNAs有111個(gè),其中61個(gè)上調(diào),50個(gè)下調(diào)；血清固定組與二期梅毒患者組間表達(dá)差異microRNAs有142個(gè),其中88個(gè)上調(diào),54個(gè)下調(diào)。(2)以Ratio≥2口P0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)二期梅毒與正常對(duì)照組間表達(dá)差異表達(dá)的1nicroRNAs有58個(gè),其中33個(gè)上調(diào),25個(gè)下調(diào)；血清固定組與正常對(duì)照組間表達(dá)差異表達(dá)microRNAs有53個(gè),其中40個(gè)上調(diào),13個(gè)下調(diào)；血清固定組與二期梅毒患者組間表達(dá)差異microRNAs有49個(gè),其中32個(gè)上調(diào),17個(gè)下調(diào)。同時(shí)預(yù)測(cè)得到新的microRNA數(shù)目為657種。3.擴(kuò)大樣本量,收集23例二期梅毒、22例梅毒血清固定患者和35例健康志愿的PBMC標(biāo)本,選擇測(cè)序結(jié)果中差異表達(dá)顯著的13種microRNA, 對(duì) miR-299-3p、 miR-451a、miR-548j-3p、miR-654-5p、miR-3135b、miR-338-5p、Novel-5、Novel-62、 Novel-73、Novel-124、Novel-128、Novel-163 和 Novel-244 行 RT-PCR分析后發(fā)現(xiàn)Novel-128 和 Novel-244在二期梅毒和梅毒固定患者PBMC中表達(dá)均降低,Novel-163只在二期梅毒中降低,而Novel-5表達(dá)升高,miR-338-5p只在梅毒血清固定患者中表達(dá)升高。4.根據(jù)GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示二期梅毒與血清固定患者差異表達(dá)的microRNA預(yù)測(cè)調(diào)控的靶基因顯著性功能包含許多種,涉及到代謝(糖、蛋白質(zhì)修飾)、生長(zhǎng)(細(xì)胞增殖及增殖中的正、負(fù)調(diào)控、細(xì)胞周期、細(xì)胞周期阻滯)、分化、凋亡(細(xì)胞凋亡、抗凋亡、誘導(dǎo)凋亡、凋亡抑制)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多方面功能；同時(shí),這些靶基因涉及的通路途徑包括：代謝途徑(固醇類生物合成、糖原合成途徑、脂肪酸合成、嘌呤、嘧啶合成途徑)、細(xì)胞生長(zhǎng)途徑(細(xì)胞周期)、連接途徑(黏附連接、緊密連接)等,細(xì)胞周期、細(xì)胞黏附等。5.Novel-224與miR-338-5p呈正相關(guān),Novel-5與Novel-128、miR-338-5p和Novel-163均呈正相關(guān),提示microRNA之間也存在一定表達(dá)或功能相關(guān)性。結(jié)論1.我們用芐星青霉素復(fù)治晚期潛伏梅毒和不明病期潛伏梅毒的血清固定患者,治療組的35例患者中有26例有效,而未復(fù)治的對(duì)照組中也有28例患者出現(xiàn)RPR滴度的下降,兩組療效統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差異,故其有效性還有待進(jìn)一步觀察,同時(shí)結(jié)果顯示梅毒血清固定患者RPR滴度可隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。2.梅毒血清固定患者外周血單個(gè)核細(xì)胞具有特異的microRNA表達(dá)譜。miR-338-5p. Novel-163、Novel-128、Novel-244和Novel-5在梅毒血清固定患者中差異表達(dá)并具有相關(guān)性,有可能作為評(píng)價(jià)治療的指標(biāo)。3. miR-338-5p、Novel-163、Novel-128、Novel-244和Novel-5及其靶基因與二期梅毒多種生物學(xué)功能,如T細(xì)胞受體信號(hào)通路、代謝、生長(zhǎng)密切相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R759.1

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本文編號(hào)：1276267