本文關鍵詞：梅毒血清固定患者的治療及其外周血單個核細胞microRNAs表達譜的研究

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【摘要】：研究背景和目的梅毒血清固定是指部分患者經(jīng)過正規(guī)驅梅方案治療后,其快速血漿血清反應素(Rapid plasma region test, RPR)滴度下降至一定水平后不再變化并長期維持低滴度,即稱為血清固定。在臨床工作中,我們經(jīng)常會給予梅毒血清固定患者經(jīng)驗性的芐星青霉素治療。然而,關于芐星青霉素對梅毒血清固定患者療效的系統(tǒng)研究相對較少。此外,梅毒血清固定的發(fā)病機制一直不清楚,有學者認為與機體免疫功能密切相關,其中microRNA可能發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。MicroRNA是一類長度約為21bp的非編碼負性調控RNA分子,參與眾多重要生理和病理途徑,包括炎癥反應、組織修復、凋亡、并在宿主抗感染免疫應答中發(fā)揮不可替代的調節(jié)作用。病原體能夠利用nicroRNA進行基因轉錄后調控,以利于微生物在宿主細胞內的復制和免疫逃逸。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)microRNA在結核分枝桿菌、幽門螺旋桿菌等感染性疾病的發(fā)生和進展過程中扮演著重要的角色,但是有關梅毒螺旋體的研究尚屬空白。因此本課題首先從臨床角度探討芐星青霉素治療梅毒血清固定患者的療效。其次,從功能基因組學角度出發(fā),運用Illumina測序技術對二期梅毒和梅毒血清固定患者外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC) microRNA進行研究,篩選鑒定出特異表達microRNA,并通過生物信息學技術研究其與靶基因及相關調控途徑,為揭示梅毒血清固定的發(fā)病機制提供有價值的研究思路。研究對象1.療效評價：從2001年1月—2013年1月期間我院皮膚性病中心有病歷記載的697例晚期潛伏梅毒和971例不明病期潛伏梅毒患者中,選擇有完整隨訪記錄的70例梅毒血清固定患者資料進行回顧性分析,其中芐星青霉素復治組的患者35例,無任何治療組患者35例。兩組平均年齡均為30歲,性別比例無顯著性差異。2. microRNA表達譜的研究：選取2013年6月—2014年6月期間就診于我院皮膚性病中心并經(jīng)血清學檢測確診的28例二期梅毒、27例梅毒血清固定患者。同期收集40例健康志愿者作為對照組。三組間性別、年齡無統(tǒng)計學差異。研究方法1.回顧性分析我院性病中心2001年1月—2013年1月期間的有完整隨訪記錄的70例梅毒血清固定患者,將其分為芐星青霉素治療組(n=35)和對照組(n=35)。治療組患者予芐星青霉素240萬單位肌注,每周1次,一共3次進行復治。對照組患者未予任何治療。復治12個月后復查RPR滴度以觀療效。以RPR下降≥2個滴度為有效,RPR下降2個滴度為無效判定結果。2.選取2013年6月—2014年6月期間在我院皮膚科性病中心診斷的二期梅毒、血清固定患者各5例,并收集5例健康志愿者作為對照組,采用新一代高通量測序技術Illumina HiSeq法對15例患者的PBMC樣本進行microRNA深度測序研究,分析差異性表達的基因,擴大樣本量,收集23例二期梅毒患者、22例梅毒血清固定患者和35例健康志愿者PBMC樣本,對顯著差異表達的microRNA進行實時熒光定量PCR (Real time-PCR, RT-PCR)驗證。利用生物信息學技術進行靶基因預測、Gene Ontology (GO)和KEGG功能注釋等分析。結果1.芐星青霉素治療組中有26例患者治療有效,9例患者治療無效,仍保持血清固定,有效率為74.2%；無任何治療的對照組中有28例患者治療有效,7例患者治療無效,有效率為80%,兩組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.所有15個樣品均建庫成功,并采用Illumina HiSeq高通量測序。二期梅毒、血清固定患者和正常對照組三組間所測的microRNAs表達水平兩兩對比后,(1)以Rati1和P0.05為標準進行篩選,發(fā)現(xiàn)二期梅毒與正常對照組間表達差異表達的microRNAs有146個,其中54個上調,92個下調；血清固定組與正常對照組間表達差異表達microRNAs有111個,其中61個上調,50個下調；血清固定組與二期梅毒患者組間表達差異microRNAs有142個,其中88個上調,54個下調。(2)以Ratio≥2口P0.05為標準進行篩選,發(fā)現(xiàn)二期梅毒與正常對照組間表達差異表達的1nicroRNAs有58個,其中33個上調,25個下調；血清固定組與正常對照組間表達差異表達microRNAs有53個,其中40個上調,13個下調；血清固定組與二期梅毒患者組間表達差異microRNAs有49個,其中32個上調,17個下調。同時預測得到新的microRNA數(shù)目為657種。3.擴大樣本量,收集23例二期梅毒、22例梅毒血清固定患者和35例健康志愿的PBMC標本,選擇測序結果中差異表達顯著的13種microRNA, 對 miR-299-3p、 miR-451a、miR-548j-3p、miR-654-5p、miR-3135b、miR-338-5p、Novel-5、Novel-62、 Novel-73、Novel-124、Novel-128、Novel-163 和 Novel-244 行 RT-PCR分析后發(fā)現(xiàn)Novel-128 和 Novel-244在二期梅毒和梅毒固定患者PBMC中表達均降低,Novel-163只在二期梅毒中降低,而Novel-5表達升高,miR-338-5p只在梅毒血清固定患者中表達升高。4.根據(jù)GO和KEGG富集分析結果顯示二期梅毒與血清固定患者差異表達的microRNA預測調控的靶基因顯著性功能包含許多種,涉及到代謝(糖、蛋白質修飾)、生長(細胞增殖及增殖中的正、負調控、細胞周期、細胞周期阻滯)、分化、凋亡(細胞凋亡、抗凋亡、誘導凋亡、凋亡抑制)、信號轉導等多方面功能；同時,這些靶基因涉及的通路途徑包括：代謝途徑(固醇類生物合成、糖原合成途徑、脂肪酸合成、嘌呤、嘧啶合成途徑)、細胞生長途徑(細胞周期)、連接途徑(黏附連接、緊密連接)等,細胞周期、細胞黏附等。5.Novel-224與miR-338-5p呈正相關,Novel-5與Novel-128、miR-338-5p和Novel-163均呈正相關,提示microRNA之間也存在一定表達或功能相關性。結論1.我們用芐星青霉素復治晚期潛伏梅毒和不明病期潛伏梅毒的血清固定患者,治療組的35例患者中有26例有效,而未復治的對照組中也有28例患者出現(xiàn)RPR滴度的下降,兩組療效統(tǒng)計學上無差異,故其有效性還有待進一步觀察,同時結果顯示梅毒血清固定患者RPR滴度可隨著時間的延長而逐漸降低。2.梅毒血清固定患者外周血單個核細胞具有特異的microRNA表達譜。miR-338-5p. Novel-163、Novel-128、Novel-244和Novel-5在梅毒血清固定患者中差異表達并具有相關性,有可能作為評價治療的指標。3. miR-338-5p、Novel-163、Novel-128、Novel-244和Novel-5及其靶基因與二期梅毒多種生物學功能,如T細胞受體信號通路、代謝、生長密切相關。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R759.1

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