本文關(guān)鍵詞：表皮松解性掌跖角化癥基因型—表型相關(guān)性分析、產(chǎn)前基因診斷及基因突變敲入小鼠模型的構(gòu)建

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【摘要】：第一部分表皮松解性掌跖角化癥基因型-表型相關(guān)性分析及產(chǎn)前基因診斷 背景：表皮松解性掌跖角化癥(epidermolytic palmoplantar keratoderma, EPPK。 OMM:144200)是相對常見的致殘性常染色體顯性遺傳性皮膚病。角蛋白9基因(KRT9)為EPPK的主要致病基因,外顯率100%。 目的：繪制本研究所收集到的EPPK家系基因突變譜,分析EPPK表型與致病基因KRT9基因型之間的相關(guān)性。根據(jù)患者的需要,在致病突變明確后進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷。 方法：收集了12個漢族EPPK家系,采集外周血樣本,利用PCR-DNA測序、AS-PCR, DHPLC及RFLP確定和驗證相關(guān)KRT9基因和KRT1基因突變類型。繼而,對4個家系的高風(fēng)險患病胎兒進(jìn)行了產(chǎn)前基因診斷。 結(jié)果：(1)在本研究所涉及的11個EPPK家系或散發(fā)病例中存在5種KRT9雜合突變,分別為c.C487T (p.Arg163Trp)、c.T470C (p.Met157Trp)、c.T1373C (p.Leu458Pro)、c.G488A (p.Argl63Gln)、c.A482G (p.Asn161Ser),并且c.C487T (p.Arg163Trp)為發(fā)生頻率最高的突變型,占41.7%(5/12)；一個EPPK家系患者未發(fā)現(xiàn)任何KRT9或KRT1基因突變；(2)除了典型的掌跖部表皮彌漫性增厚外67%(8/12),EPPK家系患者還存在指節(jié)墊表型,且大部分患者形成的指節(jié)墊與外力摩擦無關(guān)聯(lián),提示指節(jié)墊可能是KRT9突變引起的另一個原發(fā)癥狀；3個家系的部分患者還伴發(fā)先天性指屈曲表型,其KRT9突變?yōu)閜.Asn161Ser和p.Leu458Pro,推測先天性指屈曲還可能與環(huán)境因素有關(guān)；(3)利用羊水DNA-PCR-Sanger測序的方法,成功地完成了4例產(chǎn)前基因診斷,其中3例為正常胎兒,1例為致病突變攜帶胎兒。 結(jié)論：KRT9突變基因型和EPPK表型之間存在復(fù)雜的相關(guān)性,遺傳異質(zhì)性可能受環(huán)境因素、多態(tài)性核苷酸位點或修飾基因等未知因素的影響。指節(jié)墊可能為KRT9突變引起的另一個原發(fā)癥狀,而先天性指屈曲的形成可能受環(huán)境因素影響較大。開展基于KRT9基因突變檢測的產(chǎn)前DNA診斷對于EPPK的預(yù)防非常關(guān)鍵。 第二部分表皮松解性掌跖角化癥KRT9基因突變敲入小鼠模型的構(gòu)建 背景：建立EPPK的動物模型,不僅可為探討疾病發(fā)生的分子和細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制提供線索,而且可以作為一種理想的活體用于疾病的基因治療、新藥研發(fā)等諸多研究。 目的：為了更好地在成體和細(xì)胞水平上了解EPPK的發(fā)生發(fā)展和K9蛋白的功能,為EPPK的后續(xù)基因治療和臨床用藥治療等研究奠定堅實的理論及實踐基礎(chǔ)。方法：通過構(gòu)建與EPPK患者KRT9突變c.500delAinsGGCT同源性的小鼠Krt9基因c.434delAinsGGCT突變載體,利用同源重組原理基因打靶小鼠胚胎干細(xì)胞-囊胚注射后,移植到假孕鼠子宮獲得嵌合鼠的出生。通過嵌合鼠與野生型母鼠的配繁,篩選得到穩(wěn)定遺傳的Krt9基因突變敲入小鼠。通過表型分析、組織學(xué)檢測、蛋白印跡實驗和免疫組化分析等系統(tǒng)評估小鼠的表型,初步探討EPPK發(fā)病的分子機(jī)制。 結(jié)果：(1)Krt9/c.434delAinsGGCT雜合突變小鼠在出生后3-4周即出現(xiàn)前、后爪足墊區(qū)皮膚黑色過度角化斑,且隨著時間的推移更加趨向明顯。表型出現(xiàn)增厚-蛻皮-增厚的變化,周期為3周左右；(2)石蠟切片HE染色結(jié)果顯示,突變小鼠足墊區(qū)皮膚角質(zhì)層增厚,棘層、顆粒層細(xì)胞增多和空泡樣改變。掃描電鏡分析顯示,突變小鼠足墊區(qū)皮膚出現(xiàn)破裂松解性改變,透射電鏡觀察到在棘層、顆粒層細(xì)胞中存在空泡樣改變和黑色異常蛋白聚集顆粒物的出現(xiàn)；(3)蛋白表達(dá)分析結(jié)果顯示,在突變小鼠足墊區(qū)表皮中出現(xiàn)K5、K2蛋白表達(dá)量的下調(diào),K10、K6和K16蛋白表達(dá)量的上調(diào)；(4)免疫組化分析結(jié)果顯示,絲聚合蛋白和外披蛋白的表達(dá)量增加；Ki-67和p63蛋白表達(dá)量和分布發(fā)生改變。 結(jié)論：Krt9/c.434delAinsGGCT突變敲入小鼠在遺傳方式和表型上都高度模擬人EPPK的發(fā)生、發(fā)展,為理想的疾病模型。突變的K9蛋白可能阻礙了正常K9／K1二聚體的形成,從而導(dǎo)致作為小鼠機(jī)械承受力最大的足墊區(qū)表皮細(xì)胞骨架的崩塌,K2角蛋白的減少和抗壓能力較弱的其他角蛋白--K10、K6和K16代償性地表達(dá)增高,可能使得上基底層細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞溶解。而基底細(xì)胞的過度增殖使得棘層、顆粒層細(xì)胞數(shù)量增多和不規(guī)整排列,可能最終導(dǎo)致了Krt9/c.434delAinsGGCT突變小鼠出現(xiàn)EPPK相似的角化過度和皮膚松解癥狀。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R758.5;R-332

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 劉江波;李明;張杏平;鐘少琴;葉永靈;賴曉娟;;伴指間關(guān)節(jié)畸形的掌跖角化病家系基因突變檢測[J];中國麻風(fēng)皮膚病雜志;2007年08期

2 賈頤舫;張愛東;楊丹彤;蓋凌;張美華;張艷萍;許觀照;吳愛華;邱毅;;表皮松解性掌跖角化癥一家系KRT9基因突變研究[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2011年06期

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本文編號：1248203