發(fā)布時(shí)間：2017-11-26 11:02

  本文關(guān)鍵詞：Gateway技術(shù)構(gòu)建人RhoD慢病毒表達(dá)載體及轉(zhuǎn)染人黑素瘤A375細(xì)胞株

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【摘要】：目的構(gòu)建人RhoD基因的慢病毒載體并進(jìn)行慢病毒包裝和鑒定,轉(zhuǎn)染人黑素瘤細(xì)胞A375,使其過(guò)表達(dá)RhoD蛋白,為后續(xù)研究RhoD在黑素瘤中的作用奠定基礎(chǔ)。方法 Gateway技術(shù)構(gòu)建攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP的RhoD慢病毒載體,經(jīng)PCR及基因測(cè)序鑒定后,與輔助質(zhì)粒p LV/helper-SL3,pLV/helper-SL4及p LV/helper-SL5混合采用脂質(zhì)體法制備DNA-Lipofectamine 2 000復(fù)合物,并共同轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝,產(chǎn)生相應(yīng)慢病毒顆粒,通過(guò)定量PCR方法測(cè)定病毒滴度。包裝好的慢病毒轉(zhuǎn)染人黑素瘤A375細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率;實(shí)驗(yàn)分為A375(未處理對(duì)照組)、A375-EGFP(不含目的基因的空病毒對(duì)照組)和A375-RhoD(含RhoD基因的病毒組)三組,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QPCR)及免疫印記法(western blotting,WB)驗(yàn)證RhoD在A375-RhoD組細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)。結(jié)果通過(guò)PCR、基因測(cè)序證實(shí),慢病毒表達(dá)載體pLV[Exp]-EGFP/NeoCMVh RhoD構(gòu)建成功。與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞包裝出具高效感染力的慢病毒,經(jīng)測(cè)定病毒滴度為(5.13±2)×10~8TU/m L。轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞后可見(jiàn)明顯的綠色熒光表達(dá),流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率大于80%;A375-RhoD組RhoD mRNA及蛋白水平均較A375-EGFP組和A375組細(xì)胞中明顯增高。結(jié)論成功構(gòu)建RhoD慢病毒表達(dá)載體,包裝出具高效感染力的慢病毒顆粒并成功轉(zhuǎn)染人黑素瘤A375細(xì)胞,為進(jìn)一步研究RhoD在黑素瘤中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【作者單位】： 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所病理科;中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所江蘇省皮膚病性病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國(guó)然自然科學(xué)基金(81272992) 江蘇省臨床醫(yī)學(xué)科技專項(xiàng)-醫(yī)學(xué)研究中心項(xiàng)目(BL2012003) 江蘇省自然科學(xué)基金(BK20131063) 2012年高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20121106110040)
【分類號(hào)】：R739.5
【正文快照】： efficiency was higher than 80%.Rho D m RNA and protein levels in Rho D overexpression cells(A375-Rho D)were significantly higher than that in cells infected by Lentiviral vector only expressing EGFP(A375-EGFP)and no infected cells(A375).Conclusion The re，

本文編號(hào)：1229544