本文關(guān)鍵詞：鈉氫交換子調(diào)節(jié)因子-1及β-聯(lián)蛋白在皮膚黑素瘤組織及細(xì)胞株中的表達(dá)和意義

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【摘要】：皮膚黑素瘤是一種高度惡性的黑素細(xì)胞腫瘤,不易受化療藥物的干擾且易發(fā)生轉(zhuǎn)移,預(yù)后不良。對其發(fā)病機(jī)制、治療方法的研究是國內(nèi)外皮膚腫瘤研究的熱點(diǎn)。鈉氫交換子調(diào)節(jié)因子-1(NHERF1)是一種支架蛋白,其在調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn)、運(yùn)輸中發(fā)揮著重要作用,同時(shí)它還與膜-細(xì)胞骨架連接蛋白相互作用,可以穩(wěn)定跨膜蛋白,并參與構(gòu)成上皮頂端微絨毛結(jié)構(gòu)。它還是一種調(diào)節(jié)蛋白,能與30余種蛋白質(zhì)作用并調(diào)節(jié)其功能。隨著近年來研究的深入,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中發(fā)揮著重要作用：其基因的突變或雜合性丟失可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性程度增高。其在正常細(xì)胞中通常為胞膜表達(dá),發(fā)揮抑癌作用；胞膜不表達(dá)或在胞漿及胞核中過表達(dá)則提示腫瘤惡性程度增加。然而,盡管越來越多的研究表明其在癌癥中發(fā)揮著重要的作用,但目前對其在腫瘤、尤其在皮膚惡性黑素瘤中的作用及作用機(jī)制仍知之甚少。在進(jìn)一步的研究中除了不斷探索其抗腫瘤的機(jī)制,其對腫瘤生物學(xué)行為的影響及臨床意義將成為研究重點(diǎn)。 (1) NHERF1及β-聯(lián)蛋白在皮膚黑素瘤及痣細(xì)胞痣組織中的表達(dá)及意義 為了探討NHERF1是否參與了皮膚黑素瘤的發(fā)生發(fā)展過程,我們收集47例皮膚黑素瘤組織及37例痣細(xì)胞痣組織,應(yīng)用免疫組化方法對NHERF1和β-聯(lián)蛋白在組織中的表達(dá)模式(膜表達(dá)、漿表達(dá)及核表達(dá))進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示：原位皮膚黑素瘤組織中NHERF1胞漿中等/強(qiáng)陽性表達(dá)率為38%；而侵襲性皮膚黑素瘤組織中NHERF1胞漿中等/強(qiáng)陽性表達(dá)率為71%,兩組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。同時(shí),全部皮膚黑素瘤組織中NHERF1胞漿中等/強(qiáng)陽性表達(dá)率為60%,而痣細(xì)胞痣組織中NHERF1胞漿中等/強(qiáng)陽性表達(dá)率為0,有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。原位皮膚黑素瘤組織中可見β-聯(lián)蛋白胞漿中等/強(qiáng)陽性表達(dá)率為50%；而侵襲性皮膚黑素瘤組織中可見β-聯(lián)蛋白胞漿中等/強(qiáng)陽性表達(dá)率為84%。全部皮膚黑素瘤組織中β-聯(lián)蛋白胞漿中等/強(qiáng)陽性表達(dá)率為72%,而在痣細(xì)胞痣組織中β-聯(lián)蛋白胞漿中等/強(qiáng)陽性表達(dá)率為30%,兩組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。NHERF1及β-聯(lián)蛋白在痣細(xì)胞痣、原位黑素瘤及侵襲性黑素瘤組織中的胞漿陽性表達(dá)率均隨著病變組織的惡性程度增加而升高。為了進(jìn)一步探討NHERF1對β-聯(lián)蛋白及黑素瘤的影響,我們將在實(shí)驗(yàn)的第三部分,利用shRNA干擾技術(shù)進(jìn)行深入的了解。 (2) NHERF1及β-聯(lián)蛋白在黑素瘤細(xì)胞株A375,M14,MV3中的表達(dá)及意義 從第一部分的研究中觀察到NHERF1及β-聯(lián)蛋白在痣細(xì)胞痣、原位黑素瘤及侵襲性黑素瘤組織中的異常胞漿陽性表達(dá)率隨著病變組織的惡性程度增加而升高。為了研究NHERF1及β-聯(lián)蛋白在黑素瘤細(xì)胞株A375,M14,MV3中的表達(dá)及意義。培養(yǎng)黑素瘤細(xì)胞株A375、M14、MV3及黑素細(xì)胞；使用免疫細(xì)胞化學(xué)法、實(shí)時(shí)熒光定量-PCR法、免疫印跡法對黑素瘤細(xì)胞株A375、M14、MV3及黑素細(xì)胞中NHERF1及β-聯(lián)蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行觀察；并使用MTT法對黑素瘤細(xì)胞株A375、M14、MV3及黑素細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：NHERF1及β-聯(lián)蛋白在黑素細(xì)胞中同時(shí)表現(xiàn)為細(xì)胞膜陽性表達(dá),而在黑素瘤細(xì)胞株A375, M14, MV3中均出現(xiàn)膜表達(dá)的缺失,同時(shí)呈現(xiàn)不同程度的細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核陽性表達(dá)。在三株黑素瘤細(xì)胞株中,MV3細(xì)胞中的NHERF1免疫細(xì)胞化學(xué)染色僅呈少部分細(xì)胞胞質(zhì)弱陽性表達(dá),實(shí)時(shí)熒光定量-PCR檢測NHERF1的mRNA表達(dá)水平最低,免疫印跡法中未見NHERF1蛋白表達(dá)條帶,而其在MTT法中檢測到的的增殖速度最快,明顯高于另外兩株細(xì)胞；A375細(xì)胞中的NHERF1免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈細(xì)胞漿及細(xì)胞核的強(qiáng)陽性表達(dá),實(shí)時(shí)熒光定量-PCR檢測NHERF1的mRNA表達(dá)水平最高,免疫印跡法中可見NHERF1蛋白最強(qiáng)陽性表達(dá),而其增殖速度卻明顯慢于MV3細(xì)胞。同時(shí),p-聯(lián)蛋白在MV3細(xì)胞中免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈細(xì)胞漿及細(xì)胞核的強(qiáng)陽性表達(dá),實(shí)時(shí)熒光定量-PCR檢測的mRNA表達(dá)水平最高,免疫印跡法檢測到蛋白最強(qiáng)陽性表達(dá)；而A375細(xì)胞及M14細(xì)胞中,p-聯(lián)蛋白在免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈相對弱的細(xì)胞漿陽性表達(dá),實(shí)時(shí)熒光定量-PCR檢測的mRNA表達(dá)水平明顯較低；免疫印跡法中的蛋白表達(dá)較MV3中的表達(dá)低。與正常黑素細(xì)胞相比,黑素瘤細(xì)胞A375, M14, MV3中的NHERF1的mRNA表達(dá)水平都呈不同程度升高,而β-聯(lián)蛋白表達(dá)水平(mRNA表達(dá)水平及蛋白水平)亦存在不同程度升高,同時(shí),黑素瘤細(xì)胞中的NHERF1與p-聯(lián)蛋白存在著差異性表達(dá),黑素瘤細(xì)胞胞漿中的NHERF1表達(dá)量可能與細(xì)胞的增殖速度相關(guān),NHERF1在黑素瘤細(xì)胞中表達(dá)程度越低則細(xì)胞的增殖可能越快。為了深入探討NHERF1在黑素瘤細(xì)胞中對β-聯(lián)蛋白及黑素瘤細(xì)胞增殖的影響,我們將在實(shí)驗(yàn)的第三部分,利用慢病毒載體shRNA干擾技術(shù)進(jìn)行深入的了解。 (3) A375細(xì)胞中NHERF1的基因沉默對β-聯(lián)蛋白的表達(dá)及A375細(xì)胞增殖、凋亡的影響作用 從第二部分的研究中觀察到,黑素瘤細(xì)胞中的NHERF1與β-聯(lián)蛋白存在著差異性表達(dá)。黑素瘤細(xì)胞胞漿中的NHERF1表達(dá)量可能與細(xì)胞的增殖速度相關(guān),NHERF1在黑素瘤細(xì)胞中表達(dá)程度越低則細(xì)胞的增殖可能越快。因此在本部分實(shí)驗(yàn)中,我們設(shè)計(jì)并合成NHERF1的shRNA干擾片段,并載入pLVX-shRNA-puro載體中,載體轉(zhuǎn)化到Ecoli感受態(tài)中。采用PCR及基因測序等方法對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。慢病毒包裝,慢病毒感染靶細(xì)胞,多克隆細(xì)胞的驗(yàn)證,單克隆篩選穩(wěn)定干擾NHERF1的A375細(xì)胞株,并采用酶切鑒定、基因測序、qPCR和Western blotting對轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行鑒定。使用Western blotting檢測穩(wěn)定干擾NHERF1的A375細(xì)胞株中NHERF1及β-聯(lián)蛋白的蛋白表達(dá)量,以對照序列干擾細(xì)胞為對照,并使用MTT法檢測兩種細(xì)胞的增殖情況,Annexin-V/PI雙染,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)的shRNA-NHERF1干擾片段載入pLVX-shRNA-puro載體中,并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞后,經(jīng)qPCR和Western blotting檢測NHERF1表達(dá)明顯下降,NHERF1沉默的A375細(xì)胞中β-聯(lián)蛋白較對照細(xì)胞中的表達(dá)增高,同時(shí)A375細(xì)胞的增殖速度較對照細(xì)胞明顯增快。所設(shè)計(jì)的shRNA-NHERF1干擾片段對A375細(xì)胞中NHERF1的表達(dá)起到了明顯的抑制作用,NHERF1基因沉默導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白的表達(dá)增高,細(xì)胞增殖加快,細(xì)胞凋亡減少。 結(jié)論 在皮膚黑素瘤細(xì)胞中NHERF1與β-聯(lián)蛋白呈差異性表達(dá),并可能通過與β-聯(lián)蛋白的相互作用而調(diào)節(jié)β-聯(lián)蛋白的表達(dá)水平,從而影響細(xì)胞增殖和凋亡。NHERF1在皮膚黑素瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)較良性痣細(xì)胞痣組織及正常黑素細(xì)胞均呈不同程度的異常細(xì)胞漿陽性表達(dá)模式。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 楊松,李慎秋;β連環(huán)蛋白與惡性黑素瘤的研究現(xiàn)狀[J];國外醫(yī)學(xué).皮膚性病學(xué)分冊;2005年01期

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本文編號(hào)：1212460