本文關鍵詞：鈉氫交換子調節(jié)因子-1及β-聯(lián)蛋白在皮膚黑素瘤組織及細胞株中的表達和意義

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【摘要】：皮膚黑素瘤是一種高度惡性的黑素細胞腫瘤,不易受化療藥物的干擾且易發(fā)生轉移,預后不良。對其發(fā)病機制、治療方法的研究是國內外皮膚腫瘤研究的熱點。鈉氫交換子調節(jié)因子-1(NHERF1)是一種支架蛋白,其在調節(jié)離子轉運、運輸中發(fā)揮著重要作用,同時它還與膜-細胞骨架連接蛋白相互作用,可以穩(wěn)定跨膜蛋白,并參與構成上皮頂端微絨毛結構。它還是一種調節(jié)蛋白,能與30余種蛋白質作用并調節(jié)其功能。隨著近年來研究的深入,有學者發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中發(fā)揮著重要作用：其基因的突變或雜合性丟失可導致腫瘤細胞的惡性程度增高。其在正常細胞中通常為胞膜表達,發(fā)揮抑癌作用；胞膜不表達或在胞漿及胞核中過表達則提示腫瘤惡性程度增加。然而,盡管越來越多的研究表明其在癌癥中發(fā)揮著重要的作用,但目前對其在腫瘤、尤其在皮膚惡性黑素瘤中的作用及作用機制仍知之甚少。在進一步的研究中除了不斷探索其抗腫瘤的機制,其對腫瘤生物學行為的影響及臨床意義將成為研究重點。 (1) NHERF1及β-聯(lián)蛋白在皮膚黑素瘤及痣細胞痣組織中的表達及意義 為了探討NHERF1是否參與了皮膚黑素瘤的發(fā)生發(fā)展過程,我們收集47例皮膚黑素瘤組織及37例痣細胞痣組織,應用免疫組化方法對NHERF1和β-聯(lián)蛋白在組織中的表達模式(膜表達、漿表達及核表達)進行檢測。結果顯示：原位皮膚黑素瘤組織中NHERF1胞漿中等/強陽性表達率為38%；而侵襲性皮膚黑素瘤組織中NHERF1胞漿中等/強陽性表達率為71%,兩組相比具有統(tǒng)計學顯著性差異。同時,全部皮膚黑素瘤組織中NHERF1胞漿中等/強陽性表達率為60%,而痣細胞痣組織中NHERF1胞漿中等/強陽性表達率為0,有明顯統(tǒng)計學差異。原位皮膚黑素瘤組織中可見β-聯(lián)蛋白胞漿中等/強陽性表達率為50%；而侵襲性皮膚黑素瘤組織中可見β-聯(lián)蛋白胞漿中等/強陽性表達率為84%。全部皮膚黑素瘤組織中β-聯(lián)蛋白胞漿中等/強陽性表達率為72%,而在痣細胞痣組織中β-聯(lián)蛋白胞漿中等/強陽性表達率為30%,兩組相比具有統(tǒng)計學顯著性差異。NHERF1及β-聯(lián)蛋白在痣細胞痣、原位黑素瘤及侵襲性黑素瘤組織中的胞漿陽性表達率均隨著病變組織的惡性程度增加而升高。為了進一步探討NHERF1對β-聯(lián)蛋白及黑素瘤的影響,我們將在實驗的第三部分,利用shRNA干擾技術進行深入的了解。 (2) NHERF1及β-聯(lián)蛋白在黑素瘤細胞株A375,M14,MV3中的表達及意義 從第一部分的研究中觀察到NHERF1及β-聯(lián)蛋白在痣細胞痣、原位黑素瘤及侵襲性黑素瘤組織中的異常胞漿陽性表達率隨著病變組織的惡性程度增加而升高。為了研究NHERF1及β-聯(lián)蛋白在黑素瘤細胞株A375,M14,MV3中的表達及意義。培養(yǎng)黑素瘤細胞株A375、M14、MV3及黑素細胞；使用免疫細胞化學法、實時熒光定量-PCR法、免疫印跡法對黑素瘤細胞株A375、M14、MV3及黑素細胞中NHERF1及β-聯(lián)蛋白的表達情況進行觀察；并使用MTT法對黑素瘤細胞株A375、M14、MV3及黑素細胞的增殖情況進行檢測。結果發(fā)現(xiàn)：NHERF1及β-聯(lián)蛋白在黑素細胞中同時表現(xiàn)為細胞膜陽性表達,而在黑素瘤細胞株A375, M14, MV3中均出現(xiàn)膜表達的缺失,同時呈現(xiàn)不同程度的細胞漿和/或細胞核陽性表達。在三株黑素瘤細胞株中,MV3細胞中的NHERF1免疫細胞化學染色僅呈少部分細胞胞質弱陽性表達,實時熒光定量-PCR檢測NHERF1的mRNA表達水平最低,免疫印跡法中未見NHERF1蛋白表達條帶,而其在MTT法中檢測到的的增殖速度最快,明顯高于另外兩株細胞；A375細胞中的NHERF1免疫細胞化學染色呈細胞漿及細胞核的強陽性表達,實時熒光定量-PCR檢測NHERF1的mRNA表達水平最高,免疫印跡法中可見NHERF1蛋白最強陽性表達,而其增殖速度卻明顯慢于MV3細胞。同時,p-聯(lián)蛋白在MV3細胞中免疫細胞化學染色呈細胞漿及細胞核的強陽性表達,實時熒光定量-PCR檢測的mRNA表達水平最高,免疫印跡法檢測到蛋白最強陽性表達；而A375細胞及M14細胞中,p-聯(lián)蛋白在免疫細胞化學染色呈相對弱的細胞漿陽性表達,實時熒光定量-PCR檢測的mRNA表達水平明顯較低；免疫印跡法中的蛋白表達較MV3中的表達低。與正常黑素細胞相比,黑素瘤細胞A375, M14, MV3中的NHERF1的mRNA表達水平都呈不同程度升高,而β-聯(lián)蛋白表達水平(mRNA表達水平及蛋白水平)亦存在不同程度升高,同時,黑素瘤細胞中的NHERF1與p-聯(lián)蛋白存在著差異性表達,黑素瘤細胞胞漿中的NHERF1表達量可能與細胞的增殖速度相關,NHERF1在黑素瘤細胞中表達程度越低則細胞的增殖可能越快。為了深入探討NHERF1在黑素瘤細胞中對β-聯(lián)蛋白及黑素瘤細胞增殖的影響,我們將在實驗的第三部分,利用慢病毒載體shRNA干擾技術進行深入的了解。 (3) A375細胞中NHERF1的基因沉默對β-聯(lián)蛋白的表達及A375細胞增殖、凋亡的影響作用 從第二部分的研究中觀察到,黑素瘤細胞中的NHERF1與β-聯(lián)蛋白存在著差異性表達。黑素瘤細胞胞漿中的NHERF1表達量可能與細胞的增殖速度相關,NHERF1在黑素瘤細胞中表達程度越低則細胞的增殖可能越快。因此在本部分實驗中,我們設計并合成NHERF1的shRNA干擾片段,并載入pLVX-shRNA-puro載體中,載體轉化到Ecoli感受態(tài)中。采用PCR及基因測序等方法對重組質粒進行鑒定。慢病毒包裝,慢病毒感染靶細胞,多克隆細胞的驗證,單克隆篩選穩(wěn)定干擾NHERF1的A375細胞株,并采用酶切鑒定、基因測序、qPCR和Western blotting對轉染效果進行鑒定。使用Western blotting檢測穩(wěn)定干擾NHERF1的A375細胞株中NHERF1及β-聯(lián)蛋白的蛋白表達量,以對照序列干擾細胞為對照,并使用MTT法檢測兩種細胞的增殖情況,Annexin-V/PI雙染,流式細胞儀檢測細胞凋亡。結果發(fā)現(xiàn)設計的shRNA-NHERF1干擾片段載入pLVX-shRNA-puro載體中,并穩(wěn)定轉染A375細胞后,經(jīng)qPCR和Western blotting檢測NHERF1表達明顯下降,NHERF1沉默的A375細胞中β-聯(lián)蛋白較對照細胞中的表達增高,同時A375細胞的增殖速度較對照細胞明顯增快。所設計的shRNA-NHERF1干擾片段對A375細胞中NHERF1的表達起到了明顯的抑制作用,NHERF1基因沉默導致β-聯(lián)蛋白的表達增高,細胞增殖加快,細胞凋亡減少。 結論 在皮膚黑素瘤細胞中NHERF1與β-聯(lián)蛋白呈差異性表達,并可能通過與β-聯(lián)蛋白的相互作用而調節(jié)β-聯(lián)蛋白的表達水平,從而影響細胞增殖和凋亡。NHERF1在皮膚黑素瘤組織及細胞中的表達較良性痣細胞痣組織及正常黑素細胞均呈不同程度的異常細胞漿陽性表達模式。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R739.5

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 楊松,李慎秋;β連環(huán)蛋白與惡性黑素瘤的研究現(xiàn)狀[J];國外醫(yī)學.皮膚性病學分冊;2005年01期

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本文編號：1212460