本文關鍵詞：激光微切割技術在常見深部真菌病分子病理診斷中的應用研究

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【摘要】：近年來,隨著骨髓移植,造血干細胞移植以及實質性器官移植等手術的增多,糖皮質激素、免疫抑制劑等藥物在臨床上的廣泛應用,導致深部真菌病發(fā)病率呈逐步上升趨勢,并且有極高的病死率。煙曲霉和白念珠菌是侵襲性真菌病(invasive fungal disease, IFD)最常見的病原菌。而在國內,孢子絲菌侵襲至皮下導致的孢子絲菌病是我國最常見的皮膚深部真菌病之一。及早診斷和干預是改善深部真菌病預后的前提,但是目前常規(guī)診斷方法有一定局限性,造成深部真菌病診斷困難,僅有5.9%-25%的患者在死亡前被確診為深部真菌病。激光微切割(Laser Cutting Microdissection, LCM)技術的出現(xiàn)和發(fā)展,為解決這一臨床難題帶來契機。本次研究中,我們利用煙曲霉、白念珠菌和申克孢子絲菌感染動物模型,探討LCM技術聯(lián)合PCR和巢式PCR (nested PCR, n-PCR)在深部真菌病分子病理診斷中的應用。全文共分三章,各章主要內容簡述如下： 第一章激光微切割在煙曲霉感染小鼠肺模型分子病理診斷中的應用研究 在本章節(jié)中,我們通過鼻吸入法構建了煙曲霉感染小鼠肺部模型。然后將小鼠左肺分成三份,一份培養(yǎng),并將菌落提取DNA作為陽性對照,一份常規(guī)HE,PAS染色,最后一份用1：10000稀釋Blankphor熒光染色,分別微切割10-20μm長的菌絲單根和3根各20份,然后提取DNA,聯(lián)合巢式PCR特異性擴增煙曲霉的18S rRNA區(qū),結果發(fā)現(xiàn)單根菌絲敏感度為90%,而3根菌絲敏感度為100%,二者無顯著性差異(χ2=0.489,P0.05)；總的敏感度為95%,特異度為95%。較之前的一項LCM聯(lián)合PCR診斷白鸛侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)的研究敏感度高。LCM聯(lián)合巢式PCR方法在診斷IPA方面敏感度高,特異性好。 第二章激光微切割在白念珠菌感染小鼠模型分子病理診斷中的應用 在本章節(jié)中,我們通過小鼠尾靜脈注射白念珠菌混懸液的方法構建了念珠菌系統(tǒng)感染小鼠腎臟模型。然后取小鼠右腎分成三份,一份培養(yǎng),提取菌落DNA,做陽性對照,一份常規(guī)HE,PAS染色,最后一份用1：10000稀釋B1ankphor熒光染色,分別微切割1和5個孢子各30份,然后提取DNA,聯(lián)合n-PCR特異性擴增白念珠菌的5.8SrRNA及其附近的ITS區(qū),單個孢子標本敏感度83.3%(25/30),5個孢子標本敏感度90%(27/30),二者無顯著性統(tǒng)計學差異(χ2=0.71,P)0.05);總敏感度為87.7%,特異度為95%。我們的研究結果表明,通過收集單個孢子即可確診大部分侵及實質性臟器的侵襲性念珠菌病(invasive Candidiasis, IC)病例。因此LCM聯(lián)合n-PCR在IC診斷方面快速,靈敏,準確,高效。 第三章激光微切割在孢子絲菌感染小鼠睪丸模型分子病理診斷中的應用 在本章節(jié)中,我們通過對小鼠左側睪丸注射孢子絲菌混懸液的方法構建了孢子絲菌感染小鼠睪丸模型。取小鼠左側睪丸分成2份,一份培養(yǎng),一份常規(guī)HE,PAS染色,分別微切割1和5個孢子各60份,然后提取DNA,分別PCR擴增孢子菌的幾丁質合成酶基因和n-PCR擴增ITS2區(qū)。在PCR組,單個孢子標本敏感度66.67%(20/30),5個孢子標本敏感度77.67%(23/30),二者之間敏感度無顯著性差異(χ2=0.567,P0.05)。在n-PCR組,單個孢子標本敏感度70.00%(21/30),5個孢子標本敏感度83.33%(25/30)二者之間敏感度無顯著性差異(χ2=0.360,P0.05)。同時,分別比較單個孢子PCR和n-PCR敏感度,以及5個孢子的PCR和n-PCR敏感度,發(fā)現(xiàn)均無顯著性差異(χ2=1.000,P0.05,χ2=0.748,P0.05),特異度為100%。結果說明孢子數(shù)量和不同的核酸擴增方法可能會影響到檢測敏感度,雖然結果無顯著性統(tǒng)計學差異。其后,LCM收集8例孢子絲菌病臨床標本中的單個孢子,分別n-PCR和PCR技術檢測。其中3例PCR, n-PCR均陽性,而1例僅n-PCR陽性,因此,PCR和n-PCR I臨床標本診斷方面的敏感度分別為37.5%和50%。我們認為這可能與甲醛固定以及PAS染色等標本處理方法影響后續(xù)DNA擴增有關。因此,LCM聯(lián)合PCR或n-PCR診斷石蠟包埋,PAS染色的標本,尤其是回顧性分析的病理組織標本,需要進一步優(yōu)化條件,提高靈敏度。 綜上所述,在基于LCM技術檢測IFD的過程中,樣本的預處理對檢測結果影響較大,而不同的菌絲/孢子數(shù)量以及不同的核酸擴增方式,可在一定程度上影響檢測結果。因此,通過進一步優(yōu)化標本處理方法,完善分子分析技術,該技術在深部真菌病的分子病理診斷,尤其是疑難病例診斷方面具有較好的臨床應用前景和實用價值。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R756

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本文編號：1183767