發(fā)布時間：2017-11-05 19:05

  本文關(guān)鍵詞：GPX3基因甲基化在惡性黑色素瘤發(fā)病機制中的研究

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【摘要】：研究背景：活性氧(reactive oxygen species, ROS)可引起DNA損傷,并參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。正常細胞在新陳代謝過程,可通過抗氧化防御機制調(diào)節(jié)氧自由基生成與消耗之間的平衡,因此可避開氧自由基的攻擊,抗氧化防御系統(tǒng)包括多種成分,比如超氧化物歧化酶,過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPX)。GPX3屬于GPX家族蛋白,是由GPX3基因表達的一種細胞外糖化酶,它可以通過各種給電子體,如谷胱甘肽,硫氧還蛋白等使體內(nèi)的磷脂、脂肪酸過氧化氫減少。過氧化氫可參與癌細胞的各種生物學(xué)行為過程,如增殖,移動性及侵襲性。因而,部分學(xué)者認為GPX3是通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)過氧化氫水平而對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到重要作用。惡性黑色素瘤是癌癥相關(guān)死亡的一個常見原因,其發(fā)病率在過去五十年迅速上升,但其分子生物學(xué)機理尚不清楚。目的：闡明GPX3是否在惡性黑色素瘤中下調(diào),如果是,其下調(diào)是否與啟動子甲基化相關(guān),并進一步探討GPX3在惡性黑色素瘤發(fā)病機制中的重要作用。方法：1)利用reverse transcriptional PCR (RT-PCR)及實時定量PCR在正常黑素細胞、惡性黑色素瘤細胞、正常皮膚組織及惡性黑色素瘤組織中檢測GPX3mRNA的表達。GPX3蛋白表達用免疫細胞化學(xué)法在正常黑色素細胞及惡性黑色素瘤細胞中檢測。2)GPX3啟動子的甲基化在正常黑色素細胞、惡性黑色素瘤細胞、正常皮膚組織及惡性黑色素瘤組織中利用methylation specific PCR (MSP)進行檢測。3)為了闡明GPX3的下調(diào)與甲基化的相關(guān)性,惡性黑色素瘤細胞用5-Aza-2'-Deoxycitidine (5-Aza)進行處理,用RT-PCR檢測GPX3的表達重現(xiàn)與否。4)為了檢測GPX3敲除對惡性黑色素瘤細胞生物學(xué)行為的影響,建立GPX3敲除穩(wěn)定細胞株(Mock-SK-MEL-24 and GPX3△-SK-MEL-24)。為了檢測GPX3敲除對惡性黑色素瘤細胞增殖、遷移及侵襲性的影響,利用GPX3敲除穩(wěn)定細胞株做了細胞增殖實驗、劃痕實驗、侵襲實驗。5)利用GPX3敲除穩(wěn)定細胞株進行致瘤性檢測,觀察GPX3敲除對腫瘤生成的影響。6)利用免疫熒光法檢測105例惡性黑色素瘤組織檢測GPX3的蛋白表達,結(jié)合患者的臨床特征進行分析,探討GPX3在惡性黑色素瘤中的臨床意義。結(jié)果：1)與HEMs相比,GPX3 mRNA的表達在惡性黑色素瘤細胞顯著降低。并且與正常皮膚組織相比,GPX3 mRNA的表達在惡性黑色素瘤組織也顯著降低。2)在HEMs中未檢測到GPX3甲基化,但在兩種惡性黑色素瘤細胞株檢測到GPX3的完全甲基化或大部分甲基化現(xiàn)象。在正常皮膚組織也未檢測到GPX3甲基化,而在惡性黑色素瘤組織檢測到GPX3的完全甲基化或大部分甲基化現(xiàn)象。3)5-Aza處理黑色素瘤細胞可使GPX3的表達重現(xiàn)。4)與Mock-SK-MEL-24相比GPX3mRNA的表達在GPX3△-SK-MEL-24顯著降低。與Mock-SK-MEL-24相比GPX3△-SK-MEL-24的增殖能力在36小時及72小時提高1.43倍及2.07倍(P0.001及P0.001)。GPX3△-SK-MEL-24的移動性及侵襲性與Mock-SK-MEL-24相比增高3.06倍(P0.001)和6.47倍(P0.001)。5)GPX3的下調(diào)可促進黑色素瘤細胞的腫瘤形成。6)惡性黑色素瘤組織中GPX3的表達主要在瘤細胞的胞漿。與轉(zhuǎn)移灶相比,GPX3的表達在原發(fā)灶更頻繁出現(xiàn)(P=0.036)。惡性黑色素瘤組織有GPX3蛋白表達,患者的生存率與無GPX3蛋白表達的患者(平均生存時間為18月)相比顯著增高(平均生存時間為71月)(P=0.013)。結(jié)論：1)在惡性黑色素瘤中GPX3基因表達是顯著下調(diào)的。2)在惡性黑色素瘤中GPX3下調(diào)和GPX3啟動子的甲基化現(xiàn)象是密切相關(guān)的。3)GPX3的表達對惡性黑色素瘤細胞增殖、遷移、侵襲性及腫瘤形成有重要作用。4)GPX3是惡性黑色素瘤的重要的預(yù)后標(biāo)志物。綜上所述,GPX3在惡性黑色素瘤發(fā)病機制中起重要作用。
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.5

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1 呂麗t，

本文編號：1145452