本文關(guān)鍵詞：溶血磷脂酸活化初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元參與膽汁淤積性瘙癢癥及其機(jī)制研究

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【摘要】：慢性瘙癢癥是一種臨床常見(jiàn)的、有時(shí)令人難以忍受的自覺(jué)癥狀,通常伴隨著多種系統(tǒng)性疾病的發(fā)生,例如:慢性肝膽系統(tǒng)疾病、慢性腎功能衰竭、惡性腫瘤、全身性感染、多種內(nèi)分泌及血液系統(tǒng)疾病等。近些年以來(lái),隨著人們生活水平的提高,大家對(duì)慢性瘙癢癥的關(guān)注度越來(lái)越高,相關(guān)領(lǐng)域的研究也逐年增加。最近發(fā)現(xiàn)了一些特異性的瘙癢神經(jīng)通路,包括一些新的瘙癢介質(zhì)以及它們的一些相應(yīng)受體,但是,慢性瘙癢癥的具體發(fā)病機(jī)制仍然不是十分清楚,故一直找不到行之有效的治療方法。近年來(lái),脂質(zhì)代謝功能障礙是臨床研究的一個(gè)重點(diǎn)和熱點(diǎn)。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)在脂質(zhì)代謝過(guò)程中,作為一種重要的中間產(chǎn)物,正越來(lái)越受到人們的關(guān)注,其主要由血小板、脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等分泌,在多種疾病中,通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。最近,Kremer等的研究發(fā)現(xiàn)在慢性膽汁淤積性瘙癢患者的血清中,找到了一種新型的致癢介質(zhì)溶血磷脂酸(LPA),其異常升高已被證實(shí)為引起慢性膽汁淤積性瘙癢的一個(gè)重要原因。又有研究表明,有一類(lèi)特異性表達(dá)在小鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的肥大細(xì)胞相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體A3(Mas-Related G-coupled Protein Receptor,MRGPRA3)與化學(xué)性瘙癢有密切關(guān)系,該受體激動(dòng)劑為氯喹。MRGPRA3陽(yáng)性神經(jīng)元與常規(guī)的組胺依賴性瘙癢行為密切相關(guān)。盡管這類(lèi)傷害性感受器在介導(dǎo)急性瘙癢刺激中發(fā)揮了一定作用,但是仍然不清楚在慢性膽汁淤積性瘙癢病理情況下,這類(lèi)神經(jīng)元的興奮性是否發(fā)生改變。經(jīng)過(guò)以上推論,我們可以假設(shè),在膽汁淤積性瘙癢癥中,LPA可能激活了癢覺(jué)特異性MRGPRA3陽(yáng)性神經(jīng)元,通過(guò)與其中的某型LPA特定受體相結(jié)合,從而使相關(guān)神經(jīng)元興奮性增加,產(chǎn)生自發(fā)性搔抓行為。在本研究的實(shí)施過(guò)程中,我們首先使用雄性C57小鼠建立膽總管結(jié)扎模型,觀察BDL手術(shù)后,在不同的時(shí)間點(diǎn),小鼠自發(fā)性搔抓行為次數(shù)的改變。然后,原代培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion,DRG)神經(jīng)元,在給予LPA刺激后,觀察LPA對(duì)小直徑DRG神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度的改變,以及對(duì)細(xì)胞膜興奮性的改變。接著,使用分子生物學(xué)方法研究參與LPA致癢的受體分型,并使用相應(yīng)基因敲除小鼠進(jìn)一步確認(rèn)LPA與受體的相互作用。最后,使用MRGPRA3轉(zhuǎn)基因小鼠,通過(guò)在體電生理實(shí)驗(yàn)方法,明確LPA與MRGPRA3陽(yáng)性神經(jīng)元相關(guān)的細(xì)胞作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.膽汁淤積性小鼠自發(fā)性瘙癢的搔抓次數(shù)增加動(dòng)物行為學(xué)結(jié)果顯示,隨著膽總管結(jié)扎時(shí)間的延長(zhǎng),與對(duì)照組小鼠相比,膽汁淤積型小鼠在膽總管結(jié)扎術(shù)術(shù)后出現(xiàn)一定次數(shù)的自發(fā)性瘙癢行為,在術(shù)后第10天,1小時(shí)內(nèi)膽汁淤積癥誘發(fā)的自發(fā)性瘙癢抓撓行為達(dá)到峰值,然后開(kāi)始逐漸下降,并觀察到第14天結(jié)束。2.LPA增加小直徑神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子水平與細(xì)胞膜興奮性分別對(duì)假手術(shù)組與BDL組模型小鼠的DRG神經(jīng)元進(jìn)行原代培養(yǎng),通過(guò)使用鈣成像技術(shù)(鈣離子成像的比率計(jì)),分別比較在LPA刺激后,不同模型組間DRG小直徑神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子對(duì)LPA反應(yīng)性改變的差異,我們發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組小鼠的DRG小直徑神經(jīng)元相比,膽總管結(jié)扎手術(shù)組小鼠的DRG小直徑神經(jīng)元中的陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞,所引起的鈣離子反應(yīng)幅度的增加比例更高,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而且,假手術(shù)組小鼠的DRG小直徑神經(jīng)元對(duì)LPA有反應(yīng)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比大約為21.2%左右,相反,對(duì)于膽總管結(jié)扎手術(shù)組小鼠的DRG小直徑神經(jīng)元,其對(duì)LPA有反應(yīng)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比顯著增加,達(dá)到46.2%左右,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上這些結(jié)果可以說(shuō)明,與假手術(shù)組相比,在膽總管結(jié)扎術(shù)后,LPA能引起小鼠DRG神經(jīng)元中介導(dǎo)傷害性感覺(jué)的小直徑神經(jīng)元對(duì)LPA有反應(yīng)的陽(yáng)性細(xì)胞比例增加,胞內(nèi)鈣離子反應(yīng)幅度也增加,且增加的鈣離子部分是由于胞外的游離鈣進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)所引起的。局部使用LPA能夠使DRG小直徑神經(jīng)元的靜息膜電位(RMP)引起明顯放電,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而且,細(xì)胞膜去極化能夠使這些有反應(yīng)的神經(jīng)元誘發(fā)動(dòng)作電位(AP)放電。在LPA處理的過(guò)程中,平均輸入電阻(Rin)顯著降低,基強(qiáng)度降低,2倍基強(qiáng)度誘發(fā)的動(dòng)作電位數(shù)量增加,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這表明靜息離子通道的開(kāi)放增加。以上結(jié)果表明,LPA能直接激活膽總管結(jié)扎模型組小鼠的初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元。3.LPA通過(guò)LPA4型受體增加搔抓行為、胞內(nèi)鈣離子水平與細(xì)胞膜興奮性使用Real-time PCR法來(lái)檢測(cè)BDL術(shù)后小鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)中不同亞型的溶血磷脂酸受體(LPAR1-6)的表達(dá)水平。PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組小鼠相比較,BDL術(shù)后10天小鼠LPAR4型受體m RNA表達(dá)水平明顯升高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,然而LPAR1-3,5,6型受體并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。對(duì)LPAR4基因敲除小鼠進(jìn)行同樣的膽總管結(jié)扎術(shù)操作,與野生型小鼠相比較,LPAR4基因敲除小鼠在膽總管結(jié)扎術(shù)后的第10天到第14天,自發(fā)性瘙癢搔抓行為計(jì)數(shù)明顯減少。局部使用LPA刺激LPA4-/-的小直徑神經(jīng)元,與假手術(shù)組相比,膽總管結(jié)扎組LPA4-/-小鼠的DRG小神經(jīng)元對(duì)LPA反應(yīng)陽(yáng)性的百分比顯著降低,有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而且,與野生組小鼠相比,LPA引起的LPA4-/-組小鼠小神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子反應(yīng)的陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)目和增加幅度均顯著減弱。我們又發(fā)現(xiàn),與野生型小鼠相比,LPA引起LPA4基因敲除小鼠靜息膜電位的去極化明顯減弱,平均輸入電阻(Rin)增加,基強(qiáng)度增加,兩倍基強(qiáng)度誘發(fā)的動(dòng)作電位數(shù)目減少。4.LPA通過(guò)LPA4介導(dǎo)MRGPRA3癢覺(jué)神經(jīng)元參與的膽汁郁積癥性瘙癢癥使用Mrgpr A3+轉(zhuǎn)基因小鼠,原代培養(yǎng)神經(jīng)元,局部使用LPA能引起膽總管結(jié)扎模型組小鼠Mrgpr A3陽(yáng)性神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子反應(yīng)顯著性增加。通過(guò)在體電生理技術(shù),局部使用LPA能引起B(yǎng)DL組Mrgpr A3+神經(jīng)元興奮性增加。綜上所述,通過(guò)本研究,我們發(fā)現(xiàn)膽汁淤積性小鼠自發(fā)性瘙癢的搔抓次數(shù)增加。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)LPA與LPA4受體特異性結(jié)合,局部使用能夠增加神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子反應(yīng)的陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)目、反應(yīng)幅度和細(xì)胞膜的興奮性,LPA所致的膽汁淤積性瘙癢癥中部分是由氯喹參與的,屬于非組胺依賴性瘙癢,與臨床上的“使用抗組胺藥來(lái)治療膽汁淤積性瘙癢癥無(wú)效”這一觀點(diǎn)基本保持一致。而且,我們又發(fā)現(xiàn)LPA是通過(guò)LPA4受體介導(dǎo)MRGPRA3癢覺(jué)神經(jīng)元參與的膽汁郁積癥性瘙癢癥。
【關(guān)鍵詞】：膽汁淤積性瘙癢 溶血磷脂酸 脊髓背根神經(jīng)節(jié) MrgprA3陽(yáng)性神經(jīng)元
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R758.31
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 縮略詞表12-14
• 前言14-17
• 第一部分 小鼠膽汁淤積性瘙癢癥的在體行為與離體細(xì)胞研究17-39
• 材料與方法17-25
• 結(jié)果25-35
• 討論35-39
• 第二部分 LPA4受體參與膽汁郁積癥性瘙癢癥的離體機(jī)制研究39-53
• 材料與方法39-46
• 結(jié)果46-52
• 討論52-53
• 第三部分 MRGPRA3癢覺(jué)神經(jīng)元介導(dǎo)膽汁郁積性瘙癢癥的機(jī)制研究53-64
• 材料與方法53-60
• 結(jié)果60-62
• 討論62-64
• 全文小結(jié)64-65
• 參考文獻(xiàn)65-74
• 綜述74-88
• 參考文獻(xiàn)83-88
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說(shuō)明88-91
• 致謝91

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