發(fā)布時間：2017-10-31 11:04

  本文關(guān)鍵詞：Caveolin-1在尖銳濕疣角質(zhì)形成細胞中的表達及與細胞增殖和凋亡的相關(guān)性

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【摘要】：研究背景和目的：尖銳濕疣是由人乳頭瘤病毒感染引起的皮膚和黏膜良性贅生物,好發(fā)于性活躍的中青年,是臨床最常見的性傳播疾病之一。近年來,其發(fā)病率不斷上升。尖銳濕疣具有潛伏期長、傳染性強、生長迅速、反復(fù)發(fā)作、治療遷延等特點,部分患者短期內(nèi)因疣體過度增殖而形成巨大型尖銳濕疣,少數(shù)亦有惡變的可能,對社會和家庭危害極大,嚴(yán)重影響患者的身心健康,因此研究其發(fā)病機制對于尖銳濕疣的防治具有十分重要的意義。目前大量研究證實角質(zhì)形成細胞的過度增殖和異常凋亡是尖銳濕疣發(fā)病的主要環(huán)節(jié),但具體的發(fā)病機制目前仍未明確。Caveolae是細胞質(zhì)膜表面特異性的60-80nm大小內(nèi)陷微區(qū),主要介導(dǎo)細胞的內(nèi)化和胞吞轉(zhuǎn)運,并且是細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的信使中心,是細胞膜上對細胞外的信號分子的識別、分隔和傳導(dǎo)的中心區(qū)域。Caveolin-1是Caveolae上的主要結(jié)構(gòu)蛋白和標(biāo)志性蛋白,介導(dǎo)Caveolae結(jié)構(gòu)的形成。Caveolin-1基因定位于人類染色體7q31.1-31.2。Caveolin-1蛋白分子量為22kD,由178個氨基酸組成,其結(jié)構(gòu)主要包括中央高度保守的疏水區(qū)和兩側(cè)可變的N端、C端區(qū)域,在細胞膜內(nèi)具有特殊的發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)。Caveolin-1蛋白廣泛存在于許多高度分化的細胞,如上皮細胞、內(nèi)皮細胞、脂肪細胞、成纖維細胞等。Caveolin-1蛋白N端的一段氨基酸序列如同形成的腳手架,又稱為腳手架區(qū)域。Caveolin-1的腳手架區(qū)域能夠與多種位于質(zhì)膜的信號分子蛋白結(jié)合,包括表皮生長因子受體,內(nèi)皮一氧化氮合酶,整合素,神經(jīng)生長因子等,實現(xiàn)對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控。Caveolin-1在很多生理、病理活動中扮演著重要的角色,不僅參與細胞增殖、凋亡、分化、遷移及血管的生成,并且與病原體感染、糖尿病、動脈粥樣硬化、系統(tǒng)性硬化及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移等過程也密切相關(guān)。其中Caveolin-1與細胞增殖,凋亡的關(guān)系是目前研究的熱點,已有大量研究證實Caveolin-1可調(diào)控多種細胞的增殖和凋亡,其表達的改變參與了多種疾病的發(fā)病。并且在許多疾病中,Caveolin-1蛋白的表達水平與患者的臨床數(shù)據(jù)具有密切相關(guān)性,Caveolin-1蛋白可作為判斷病情一個生物學(xué)標(biāo)記。Caveolin-1在尖銳濕疣中表達是否發(fā)生改變?是否參與了角質(zhì)形成細胞的異常增殖、凋亡以及尖銳濕疣的發(fā)病?其表達水平與尖銳濕疣患者各臨床參數(shù)有何關(guān)系?這一系列問題目前國內(nèi)外未見有關(guān)研究報道。本課題第一部分檢測Caveolin-1在尖銳濕疣角質(zhì)形成細胞中的表達,并與正常皮膚進行對比。再分析Caveolin-1的表達量與尖銳濕疣患者各臨床參數(shù)的關(guān)系,旨在研究Caveolin-1是否參與尖銳濕疣的發(fā)病,并判斷其是否可作為判斷病情的一個生物學(xué)標(biāo)記。本課題第二部分通過比較尖銳濕疣和正常包皮角質(zhì)形成細胞的增殖指數(shù)和凋亡指數(shù),并分析尖銳濕疣角質(zhì)形成細胞中Caveolin-1的表達與增殖指數(shù)、凋亡指數(shù)的相關(guān)性,旨在探討Caveolin-1在尖銳濕疣發(fā)病中的作用機制。本課題第三部分通過RNA干擾技術(shù),下調(diào)人角質(zhì)形成細胞系Hacat細胞中Caveolin-1的表達,研究下調(diào)Caveolin-1表達對Hacat細胞增殖,凋亡的影響,旨在進一步明確Caveolin-1蛋白與角質(zhì)形成細胞增殖,凋亡的關(guān)系。研究方法：1.收集尖銳濕疣患者的組織標(biāo)本和臨床資料。通過免疫組化法來檢測尖銳濕疣角質(zhì)形成細胞中Caveolin-1蛋白的表達和分布；通過Image-Pro Plus 6.0軟件對角質(zhì)形成細胞染色進行分析,計算其平均吸光度,來對Caveolin-1蛋白的表達進行半定量量化。通過中性蛋白酶消化,分離出尖銳濕疣新鮮皮損中的表皮部分,用western blot進一步驗證尖銳濕疣角質(zhì)形成細胞中Caveolin-1蛋白的表達水平；用熒光定量real-time PCR檢測尖銳濕疣角質(zhì)形成細胞中Caveolin-1 mRNA的表達水平。最后分析Caveolin-1蛋白的表達水平與尖銳濕疣患者各臨床參數(shù)的相關(guān)性。取正常成年男性包皮組織作為對照。2.通過免疫組化法標(biāo)記增殖細胞核抗原(PCNA),來檢測尖銳濕疣中增殖的角質(zhì)形成細胞,并計算其增殖指數(shù)；通過末端標(biāo)記法(TUNEL)來檢測尖銳濕疣中凋亡的角質(zhì)形成細胞,并計算其凋亡指數(shù)。分析尖銳濕疣角質(zhì)形成細胞中Caveolin-1蛋白的表達與其增殖指數(shù)、凋亡指數(shù)的相關(guān)性。取正常成年男性包皮組織作為對照。3.設(shè)計三條針對Caveolin-1基因的siRNA,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA導(dǎo)入Hacat細胞。用熒光定量real-time PCR方法來篩選出抑制效果最佳的那條siRNA,以及最佳的起效濃度。用篩選出的最有效siRNA在最佳起效濃度下轉(zhuǎn)染Hacat細胞,并設(shè)為實驗組；轉(zhuǎn)染非特異序列的Hacat細胞為陰性對照組,未轉(zhuǎn)染的Hacat細胞為空白對照組。通過western blot和免疫熒光驗證轉(zhuǎn)染siRNA后Hacat細胞中Caveolin-1蛋白表達的改變。MTS法分別檢測干擾Caveolin-1基因24h、48 h、72h后Hacat細胞增殖的變化。流式細胞儀(FCM)檢測干擾Caveolin-1基因48 h后Hacat細胞凋亡的情況。4.統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS20.0軟件進行分析,數(shù)據(jù)以x±s來表示。Caveolin-1的表達、增殖指數(shù)和凋亡指數(shù)的比較采用兩獨立樣本t檢驗。Caveolin-1的表達與尖銳濕疣患者臨床數(shù)據(jù)的關(guān)系的分析采用兩獨立樣本的t檢驗(臨床參數(shù)的分類為2類)或者單因素方差分析(臨床參數(shù)的分類大于2類)。Caveolin-1的表達與增殖指數(shù)、凋亡指數(shù)的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。3組細胞之間的比較采用單因素方差分析(組間均數(shù)多重比較采用LSD法)。采用雙側(cè)檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：1. Caveolin-1在尖銳濕疣角質(zhì)形成細胞中的表達及與各臨床參數(shù)的相關(guān)性：1.1免疫組化結(jié)果顯示：Caveolin-1蛋白在角質(zhì)形成細胞中呈胞漿和胞膜表達,并且在尖銳濕疣和正常皮膚的角質(zhì)形成細胞中均有表達。但在尖銳濕疣組中,Caveolin-1蛋白表達主要位于基底層的角質(zhì)形成細胞,棘層和顆粒層的角質(zhì)形成細胞呈弱表達或無表達,而在正常皮膚組中則為表皮全層表達。尖銳濕疣組和正常皮膚組中角質(zhì)形成細胞Caveolin-1蛋白的平均吸光度分別為0.042±0.021和0.181±0.075,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=,P0.001)。1.2 western blot結(jié)果顯示：與正常表皮相比,尖銳濕疣組織表皮中的Caveolin-1蛋白表達顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t==7.533,P0.05)。1.3熒光定量real-time PCR結(jié)果顯示：與正常表皮相比,尖銳濕疣表皮中的Caveolin-1 mRNA表達顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.135,P0.05)。1.4 Caveolin-1蛋白表達與臨床參數(shù)的相關(guān)性顯示：尖銳濕疣患者皮損中角質(zhì)形成細胞的Caveolin-1蛋白表達與患者的性別,年齡,初發(fā)/復(fù)發(fā),部位,病程,HPV類型和治療后是否復(fù)發(fā)等均無顯著相關(guān)性(P均0.05)。2.尖銳濕疣角質(zhì)形成細胞中Caveolin-1的表達與細胞增殖指數(shù),凋亡指數(shù)的相關(guān)性：2.1 PCNA免疫組化結(jié)果顯示：尖銳濕疣組中增殖的角質(zhì)形成細胞在表皮全層均可見,增殖指數(shù)為(65.63±19.86)%。正常皮膚組中增殖的角質(zhì)形成細胞主要位于基底層和棘層下部,增殖指數(shù)為(23.51±4.00)%,兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.44,P0.001)。相關(guān)分析顯示,尖銳濕疣組中角質(zhì)形成細胞的增殖指數(shù)與Caveolin-1表達呈顯著負相關(guān)(r=-0.798,P0.05)。2.2 TUNEL結(jié)果顯示： 尖銳濕疣組中凋亡的角質(zhì)形成細胞位于表皮全層,其凋亡指數(shù)為(24.12±10.86)%。正常皮膚組中凋亡的角質(zhì)形成細胞散在分布于表皮上部,其凋亡指數(shù)為(3.13±1.12)%,兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.97,P0.001)。相關(guān)分析顯示,尖銳濕疣組中角質(zhì)形成細胞的凋亡指數(shù)與Caveolin-1表達呈顯著正相關(guān)(r=0.825,P0.05)。3.下調(diào)Hacat細胞中Caveolin-1表達對細胞增殖,細胞凋亡的影響：3.1熒光定量real-time PCR篩選結(jié)果： 三條針對Caveolin-1特異性的siRNA中,siRNA-2在濃度為25nM下抑制效果最佳,成功將Hacat細胞中的Caveolin-1表達降低了84.32%。3.2 Western blot結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染干擾效果最佳的siRNA后,實驗組Hacat細胞Caveolin-1的表達顯著低于空白對照組和陰性對照組(P0.05)。3.3免疫熒光結(jié)果顯示：實驗組Hacat細胞Caveolin-1的熒光強度顯著低于空白對照組和陰性對照組。3.4 MTS結(jié)果顯示：實驗組Hacat細胞在轉(zhuǎn)染24h,48h和72h后的吸光度A分別為0.563±0.013,0.628±0.006和0.811±0.018,高于空白對照組(0.541±0.009,0.575±0.012和0.722±0.004)和陰性對照組(0.536±0.006,0.571±0.015和0.719±0.002),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05),空白對照組和陰性對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.5流式結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染48h后,實驗組的Hacat細胞的凋亡率為(8.90%±0.06%),低于空白對照組(20.59%±0.87%)和陰性對照組(20.64%±0.09%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05),空白對照組和陰性對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：尖銳濕疣中角質(zhì)形成細胞的Caveolin-1蛋白和mRNA表達水平,與正常皮膚相比,均顯著下降；Caveolin-1蛋白表達水平與尖銳濕疣患者的臨床數(shù)據(jù)未見明顯相關(guān)性；尖銳濕疣中角質(zhì)形成細胞Caveolin-1蛋白的表達與其增殖指數(shù)呈負相關(guān),凋亡指數(shù)呈正相關(guān)；下調(diào)角質(zhì)形成細胞Caveolin-1蛋白的表達能夠促進其增殖,抑制其凋亡。尖銳濕疣中角質(zhì)形成細胞的Caveolin-1表達的下降,可能導(dǎo)致角質(zhì)形成細胞增殖加快,細胞凋亡減少,參與尖銳濕疣的發(fā)病。
【關(guān)鍵詞】：尖銳濕疣 Caveolin-1 角質(zhì)形成細胞 細胞凋亡 細胞增殖
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R752.53
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-20
• 主要試劑和儀器20-24
• 第一章 Caveolin-1在尖銳濕疣角質(zhì)形成細胞中的表達及與臨床資料的關(guān)系24-41
• 1. 實驗方法24-34
• 2. 結(jié)果34-38
• 3. 討論38-41
• 第二章 尖銳濕疣角質(zhì)形成細胞中Caveolin-1的表達與細胞增殖指數(shù),凋亡指數(shù)的相關(guān)性41-50
• 1. 實驗方法41-44
• 2. 結(jié)果44-48
• 3. 討論48-50
• 第三章 下調(diào)Hacat細胞中Caveolin-1表達對細胞增殖和細胞凋亡的影響50-69
• 1. 實驗方法50-63
• 2. 結(jié)果63-67
• 3. 討論67-69
• 全文總結(jié)69-70
• 參考文獻70-75
• 縮略語/符號75-76
• 碩士階段發(fā)表論文情況76-77
• 致謝77-78

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本文編號：1122055