本文關(guān)鍵詞：中國漢族人群尋常型天皰瘡全基因組關(guān)聯(lián)分析研究

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【摘要】：研究背景天皰瘡(Pemphigus)是指一組危及生命的自身免疫性大皰性疾病。特點(diǎn)為皮膚粘膜廣泛性水皰和糜爛。主要有六種臨床類型,尋常型天皰瘡(Pemphigus vulgaris,PV)是最常見且具代表性的一組臨床類型。PV在世界范圍內(nèi)發(fā)病率低:0.076-5/10萬人/年,在一些德系猶太人群和東方一些國家如印度,馬來西亞,中國和日本,發(fā)病率偏高。男女均可發(fā)病,女性多于男性。在伊朗、中國及猶太人群中對PV流行病學(xué)調(diào)查顯示患病男女比例約為1/1.5,平均發(fā)病年齡40~60歲,但亦見于兒童。該病慢性經(jīng)過,難以根治,給患者造成巨大身心壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),危害極大。PV誘發(fā)因素通常有一定遺傳素質(zhì),且表現(xiàn)多樣。大部分觸發(fā)因素來自外界環(huán)境,如:藥物攝入、病毒感染、物理因素、抗原接觸、飲食因素等。PV發(fā)病機(jī)制尚未研究清楚,總的來說,遺傳與環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致PV發(fā)生。作為一種自身免疫性疾病,體液免疫與細(xì)胞免疫均參與了PV發(fā)病,因此MHC在其發(fā)病中具有重要地位。通過血清學(xué)、候選基因及全基因組關(guān)聯(lián)分析研究(GWAS)等多種方法已證實(shí)該病與MHC及非MHC區(qū)域均相關(guān),且因不同種族及研究人群而異。PV作為一種罕見的復(fù)雜疾病,國際上對其易感基因研究相對較少,2012年,Sarig等學(xué)者運(yùn)用GWAS方法在猶太人群發(fā)現(xiàn)HLA區(qū)域與非HLA的易感基因ST18均與PV相關(guān),并對ST18基因在埃及和德國人群中進(jìn)行驗(yàn)證,僅埃及人群驗(yàn)證結(jié)果陽性,說明該基因具有人群異質(zhì)性。功能學(xué)研究進(jìn)一步證實(shí)ST18與PV發(fā)病相關(guān)。該項(xiàng)GWAS樣本量偏小(100病例VS 397例對照)。因此,目前急需在中國及世界其他人群中繼續(xù)尋找該病遺傳易感基因,并探尋該病人群異質(zhì)性,必將對PV遺傳學(xué)基礎(chǔ)及發(fā)病機(jī)制的深入理解具有積極作用,同時(shí)也為基因相關(guān)治療提供新靶點(diǎn)奠定理論依據(jù)。研究目的本研究在中國漢族人群開展PV的GWAS研究,通過初篩及驗(yàn)證兩階段實(shí)驗(yàn)篩選出可能的疾病易感SNP位點(diǎn),并將之定位于基因,探討PV可能的易感基因和發(fā)病機(jī)制。同時(shí),通過與伊朗人群PV的GWAS關(guān)聯(lián)結(jié)果進(jìn)行比較,探討中伊兩人群的遺傳異質(zhì)性。另外,本研究還對既往猶太人群GWAS發(fā)現(xiàn)的PV易感位點(diǎn)在中伊人群中進(jìn)行了驗(yàn)證,探索PV易感基因在不同種族是否存在異質(zhì)性。研究方法分2階段進(jìn)行。1初篩階段:采用Illumina公司所生產(chǎn)的高通量的Illumina Omni Zhong Hua-8 Human Bead Chips基因芯片對96例(中國48例,伊朗48例)PV患者及1,095例(中國1,031例,伊朗64例)正常對照在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行SNPs基因分型。2驗(yàn)證階段:根據(jù)初篩階段結(jié)果,篩選出最具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的易感性SNP位點(diǎn)。選點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)為:1)在中國漢族或伊朗人群初篩結(jié)果中P0.0001;2)Meta分析結(jié)果中P0.0001;3)與既往GWAS報(bào)道的顯著性位點(diǎn)位于同一關(guān)聯(lián)區(qū)域;4)位于編碼區(qū)的SNP位點(diǎn);5)既往PV-GWAS已報(bào)道SNP位點(diǎn)。將這些SNP位點(diǎn)分別在中國漢族和伊朗另外2個(gè)新的人群中進(jìn)行驗(yàn)證(中國PV患者359例vs正常對照2,211例;伊朗PV患者149例vs健康對照210例),利用Sequenom Mass Array基因分型平臺進(jìn)行SNPs分型。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)PV易感基因。結(jié)果一中國漢族人群和伊朗人群初篩結(jié)果1中國漢族人群初篩結(jié)果在初篩階段,中國漢族人群中GWAS分型結(jié)果顯示HLA區(qū)域與PV存在強(qiáng)關(guān)聯(lián)。在這個(gè)群體中,HLA-DQA1區(qū)域附近的6個(gè)SNPs具有全基因組關(guān)聯(lián)顯著性(P5×10-8),且位于同一信號區(qū)域。其中,最顯著SNP為rs3129727(P=9.90×10-11,OR=5.24)和rs3129728(P=9.90×10-11,OR=5.24)。2伊朗人群初篩結(jié)果在初篩階段,伊朗人群經(jīng)過質(zhì)量控制后,9個(gè)區(qū)域的29個(gè)SNPs超過P=1×10-4的顯著性水平。最顯著SNP rs11575840是位于HLA區(qū)域的NCR3基因(P=3.99×10-6,OR=27.33)上的一個(gè)錯義突變。3中伊兩個(gè)人群進(jìn)行Meta分析結(jié)果在初篩階段,經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)控,利用Plink 1.07軟件對中伊兩個(gè)人群進(jìn)行Meta分析,結(jié)果顯示HLA-DQA1基因附近的6個(gè)SNP與PV顯著關(guān)聯(lián),P值均小于5×10-8,達(dá)到GWAS初篩意義。最顯著SNP點(diǎn)是rs28483633(P=2.17×10-11,OR=4.73)。該6個(gè)位點(diǎn)與中國漢族人群初篩結(jié)果中最顯著的6個(gè)SNP位點(diǎn)一致,處于同一信號區(qū)域。二中國漢族人群和伊朗人群驗(yàn)證結(jié)果的比較該實(shí)驗(yàn)從中國漢族人群初篩結(jié)果中挑選了41個(gè)SNP位點(diǎn)、從伊朗人群挑選了23個(gè)SNP位點(diǎn),加上既往猶太人群PV的GWAS報(bào)道的11個(gè)顯著SNP位點(diǎn),共75個(gè)SNP位點(diǎn)納入驗(yàn)證階段。該75個(gè)位點(diǎn)在中國和伊朗2個(gè)人群中都進(jìn)行了驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果顯示,SNP位點(diǎn)rs11575840在這兩人群中均顯示與PV強(qiáng)關(guān)聯(lián):中國漢族人群(Pcombined=4.18×10-5,OR=5.68),伊朗人群(Pcombined=4.00×10-11,OR=11.19);對2人群研究結(jié)果進(jìn)行Meta分析,亦顯示該位點(diǎn)最為顯著(Pmeta=1.63×10-14,ORmeta=8.38)。除rs11575840這個(gè)最顯著的SNP點(diǎn)之外,我們在伊朗人群還發(fā)現(xiàn)了6個(gè)具有一定提示意義的易感位點(diǎn),分別是:21q22.11(rs7281523,TIAM1),4q21.21(rs2867702,PRDMB),4q34.3(rs4690504,NEIL3),2q34(rs16848535,ERBB4),6q11.1(rs6924041,KHDRBS2),和2q37.3(rs903375,LRRFIP1),(1.91×10-5≤Pcombined≤2.69×10-2,0.43≤OR≤2.21)。三驗(yàn)證既往PV-GWAS結(jié)果對既往在猶太人群報(bào)道的11個(gè)非-MHC區(qū)域易感位點(diǎn)在中伊人群進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果顯示,位于3p22.3區(qū)域的SNP位點(diǎn)rs1073208,在中國漢族人群也與PV存在關(guān)聯(lián)(Pcombined=4.25×10-2,OR=0.70;Pcombined=1.53×10-2,OR=0.67),而在伊朗人群中未見陽性驗(yàn)證結(jié)果。結(jié)論本課題首次對中國漢族人群PV進(jìn)行了一項(xiàng)GWAS研究。采用GWAS技術(shù)首次發(fā)現(xiàn),HLA-DQA1是中國漢族人群PV易感區(qū)域。本課題同時(shí)對伊朗人群PV也做了GWAS研究,并將中伊兩人群研究結(jié)果進(jìn)行了比較與Meta分析,發(fā)現(xiàn)HLA區(qū)域內(nèi)NCR3基因上一個(gè)錯義突變與這兩個(gè)人群PV發(fā)病均相關(guān)。對既往猶太人群PV-GWAS報(bào)道的易感基因在中伊兩個(gè)人群進(jìn)行了驗(yàn)證,并在中國人群驗(yàn)證出一個(gè)陽性位點(diǎn)。研究結(jié)果豐富了PV遺傳危險(xiǎn)因素,擴(kuò)展了對其遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識,建立了中國漢族人群及伊朗人群基因分型數(shù)據(jù)庫,為今后PV這一復(fù)雜性疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)研究提供了啟示。
【關(guān)鍵詞】：尋常型天皰瘡 全基因組關(guān)聯(lián)分析 易感基因
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R758.66
【目錄】：

• 英文縮略詞表7-8
• 中文摘要8-12
• Abstract12-16
• 1 引言16-22
• 1.1 研究背景16-21
• 1.1.1 疾病概述16-17
• 1.1.2 PV免疫學(xué)研究17-18
• 1.1.3 PV遺傳學(xué)研究18-21
• 1.2 研究思路21-22
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與方法22-64
• 2.1 研究設(shè)計(jì)22-25
• 2.1.1 初篩階段22
• 2.1.2 驗(yàn)證階段22-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)對象25
• 2.3 實(shí)驗(yàn)試劑25-28
• 2.3.1 DNA提取試劑25-26
• 2.3.2 電泳相關(guān)試劑26
• 2.3.3 全基因組基因分型所需試劑26-27
• 2.3.4 Sequenom Mass Array系統(tǒng)基因分型所用試劑27-28
• 2.4 實(shí)驗(yàn)儀器28-31
• 2.4.1 DNA提取器材28
• 2.4.2 電泳所用儀器28-29
• 2.4.3 測OD值儀器29
• 2.4.4 全基因組SNP分型儀器29-30
• 2.4.5 Sequenom MassArray系統(tǒng)基因分型所用儀器30-31
• 2.5 實(shí)驗(yàn)步驟31-56
• 2.5.1 全血標(biāo)本采集31
• 2.5.2 基因組DNA提取31-32
• 2.5.3 基因組DNA電泳檢測32-34
• 2.5.4 DNA濃度檢測和標(biāo)準(zhǔn)化處理（簡稱DNA標(biāo)化）34-35
• 2.5.5 全基因組SNPs基因分型35-43
• 2.5.6 Sequenom MassArray系統(tǒng)基因分型43-56
• 2.6 數(shù)據(jù)質(zhì)控與統(tǒng)計(jì)分析56-57
• 2.6.1 質(zhì)控方法56-57
• 2.6.2 統(tǒng)計(jì)方法57
• 2.7 分析軟件和電子數(shù)據(jù)庫信息查詢57-59
• 2.7.1 基因分型軟件的應(yīng)用：Plink 1.0757
• 2.7.2 Haploview的應(yīng)用57-58
• 2.7.3 R軟件的應(yīng)用58
• 2.7.4 美國國立生物技術(shù)信息中心58-59
• 2.7.5 HapMap計(jì)劃數(shù)據(jù)庫59
• 2.7.6 其他相關(guān)數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)站59
• 2.8 數(shù)據(jù)的處理59-61
• 2.8.1 初篩階段樣本質(zhì)控59-60
• 2.8.2 初篩階段SNP質(zhì)控60-61
• 2.8.3 驗(yàn)證階段的SNP質(zhì)控61
• 2.8.4 Illumiina和Sequenom MassArray的分型一致性比較61
• 2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析61-64
• 3 結(jié)果64-87
• 3.1 研究對象一般情況和SNP數(shù)據(jù)64
• 3.2 初篩階段SNP分型數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果64-77
• 3.2.1 中國漢族人群初篩結(jié)果67-70
• 3.2.2 伊朗人群初篩結(jié)果70-71
• 3.2.3 初篩階段中國漢族和伊朗人群Meta分析結(jié)果71-77
• 3.3 驗(yàn)證階段SNP分型數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果77-86
• 3.3.1 中國漢族人群驗(yàn)證結(jié)果和與伊朗人群驗(yàn)證結(jié)果的比較77-84
• 3.3.2 中國漢族人群和伊朗人群Meta結(jié)果84-86
• 3.3.3 對既往PV-GWAS報(bào)道位點(diǎn)的驗(yàn)證結(jié)果86
• 3.4 對p38和其下游效應(yīng)器MAPK蛋白激活激酶（MK2）基因在本研究中與PV相關(guān)性的觀察86-87
• 4 討論87-94
• 4.1 本研究發(fā)現(xiàn)的PV的HLA區(qū)域易感位點(diǎn)88-91
• 4.2 驗(yàn)證猶太人PV易感基因91-92
• 4.3 與其他PV相關(guān)研究的比較92-93
• 4.4 展望93-94
• 5 結(jié)論94-96
• 6 參考文獻(xiàn)96-106
• 附錄106-109
• 致謝109-111
• 課題綜述 天皰瘡遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展111-138
• 參考文獻(xiàn)126-138

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;ASSOCIATION BETWEEN PEMPHIGUS VULGARIS AND HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN IN HAN NATION OF NORTHEAST CHINA[J];Chinese Medical Sciences Journal;2005年03期

，

本文編號：1104142