本文關(guān)鍵詞：誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的甲基化檢測(cè)

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【摘要】：目的:探討分化細(xì)胞:表皮黑色素細(xì)胞(EMC:epidermal melanocytes)、表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(EKC:epidermal keratinocytes)、毛囊間質(zhì)形成細(xì)胞(FKC:hair follicles keratinocytes)、耐受胰酶消化的黑素細(xì)胞(TE-EMC:trypsinization-enduring epidermal melanocytes)及3因子-誘導(dǎo)性干細(xì)胞(3F-i PSCs:3 factors induced pluripotent stem cells)和4F-i PSCs的甲基化程度。方法:1:中性蛋白酶消化包皮組織2小時(shí)分離表真皮,再用0.25%胰酶消化表皮10分鐘,吹打、中和,獲取細(xì)胞懸液,然后種植于培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%-90%時(shí),進(jìn)行差別胰酶純化,得到純化的EMC,用培養(yǎng)基M254(含HMGS)培養(yǎng)、傳代、擴(kuò)增;同EMC,獲取純化的EKC,用含HKGS的人表皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)、傳代及擴(kuò)增;2.0.25%膠原酶處理成年患者頭皮的毛囊組織2小時(shí),分離毛囊,再用0.25%胰酶消化15分鐘、中和、吹打,獲取細(xì)胞懸液,用人表皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)(含HKGS)、傳代、擴(kuò)增:3.TE-EMC:將細(xì)胞懸液在0.25%胰酶中處理4小時(shí)、中和,更換黑素細(xì)胞培養(yǎng)基M254培養(yǎng)(含HMGS)、傳代、擴(kuò)增;4.i PSCs:將攜帶有Oct4、Klf-4和C-myc 3因子或Oct4、Klf-4、C-myc和Sox-24因子的慢病毒載體,按照MOI值15:1,細(xì)胞數(shù)4×104/ml,聚凝胺10ng/ml,維生素C10ng/ml,加入M254培養(yǎng)基,終體積為2ml的比例,轉(zhuǎn)染第三代的EMC,24小時(shí)后,去除病毒接種于鋪滿滋養(yǎng)層細(xì)胞的鼠尾膠原包被板中,用干細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng),接種后第12天,培養(yǎng)基更換為1/2完全培養(yǎng)基和1/2條件培養(yǎng)基,20天左右可見(jiàn)明顯的3F-i PSCs和4F-i PSCs克隆,挑選克隆,擴(kuò)增培養(yǎng)。5.提取各組細(xì)胞的DNA,采用BSP法檢測(cè)Oct4和Nanog兩個(gè)基因位點(diǎn)的甲基化程度。結(jié)果:EMC、TE-EMC、3F-i PSCs和4F-i PSCs的甲基化率,在Oct4啟動(dòng)子區(qū)域分別為92.5%、83.7%、48.7%、46.6%,Nanog位點(diǎn)則為72.2%、38.9%、44.4%、53.3%,它們之間改變有顯著性,但3F-i PSCs和4F-i PSCs間的甲基化程度相似。EKC和FKC的甲基化程度在Oct4位點(diǎn)差異性不明顯,而Nanog位點(diǎn)顯著。結(jié)論:1.3F-i PSCs和4F-i PSCs的甲基化程度相似;2.細(xì)胞甲基化程度與細(xì)胞來(lái)源、形態(tài)、分化程度有相關(guān)性。
【關(guān)鍵詞】：甲基化 表皮細(xì)胞 基因啟動(dòng)子區(qū)域 亞硫酸氫鈉處理后測(cè)序法
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R751
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 引言9-11
• 材料與方法11-16
• 結(jié)果16-18
• 討論18-23
• 結(jié)論23-24
• 參考文獻(xiàn)24-27
• 致謝27-28
• 附錄A 英中文術(shù)語(yǔ)縮略語(yǔ)對(duì)照表28-29
• 附錄B 攻讀學(xué)位期間獲取的獎(jiǎng)勵(lì)和科研成果29-30
• 附錄C 綜述30-38
• 參考文獻(xiàn)36-38

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 蘇遠(yuǎn)婷;誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的甲基化檢測(cè)[D];蚌埠醫(yī)學(xué)院;2015年

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本文編號(hào)：1090901