本文關(guān)鍵詞：中國人群尋常型魚鱗病及尋常型銀屑病Filaggrin突變研究

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【摘要】：尋常型魚鱗病(Ichthyosis Vulgaris, IV, OMIM#146700)是一種常見的遺傳性角化障礙性皮膚病,發(fā)病率在1：5300到1：250之間,通常在出生后一年內(nèi)發(fā)病,好發(fā)于四肢伸側(cè)及背部,以小腿最為明顯。Ⅳ臨床異質(zhì)性較大,病情輕者僅表現(xiàn)為冬季皮膚干燥、粗糙,表面有細(xì)碎的糠樣鱗屑；典型的皮損表現(xiàn)為灰褐色或深褐色菱形或多角形鱗屑,鱗屑中央固著,邊緣游離,如魚鱗狀；其他臨床特征還表現(xiàn)為掌跖線狀裂、掌紋加深、遺傳性過敏癥和熱耐受不良。 FLG失去功能的突變被公認(rèn)為是Ⅳ的致病因素。到目前為止,在尋常型魚鱗病患者中報道的FLG突變種類已接近30種。Filaggrin基因(OMIM#135940)位于1q21.3,由3個外顯子組成,3號外顯子長12.7-14.7kb,由10-12個幾乎完全一樣的重復(fù)區(qū)組成,編碼幾乎整個profilaggrin,是人類基因組外最大的外顯子之一；Filaggrin蛋白由S100鈣離子結(jié)合區(qū)、B結(jié)構(gòu)域、2個FLG不完全重復(fù)區(qū)、10-12個FLG重復(fù)區(qū)和C-端組成。C-末端結(jié)構(gòu)域是profilaggrin水解成filaggrin單體所必需的結(jié)構(gòu),FLG失去功能的突變使profilaggrin缺失C-末端結(jié)構(gòu)域而無法正常水解,最終使表皮顆粒層filaggrin單體減少或缺失。 為了鑒定3個尋常型魚鱗病家系的致病變異,本研究首先對家系的先證者開展了FLG突變研究,結(jié)果在家系1的先證者中鑒定了2個未見報道的變異(c.477-478insA, c.6218-6219delAA)和一個外來的已知致病變異c.3321delA。隨后對家系1進(jìn)行疾病共分離研究,發(fā)現(xiàn)c.477-478insA與家系1疾病共分離；c.6218-6219delAA是一個新發(fā)突變；c.3321delA與家系中外來的一支共分離。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果,我們將變異c.477-478insA與家系進(jìn)行了連鎖分析,結(jié)果得到LOD值大于1的結(jié)果,支持該位點(diǎn)與疾病連鎖；同時使用TA克隆測序方法對c.6218-6219delAA進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果證實(shí)了該位點(diǎn)是家系1先證者新發(fā)的變異；這2個突變在200個正常對照中均未檢測到,進(jìn)一步證明了它們是致病變異。此外,在家系2和3中均鑒定到了已知致病變異c.3321delA。這些結(jié)果豐富了中國人群FLG突變譜。 第二部分中國人群尋常型銀屑病Filaggrin突變研究 銀屑病(Psoriasis, OMIM#177900),是一種以紅斑、鱗屑為主要表現(xiàn)的慢性炎癥性、免疫介導(dǎo)的皮膚疾病。臨床可分為四種亞型：尋常型銀屑病、關(guān)節(jié)型銀屑病、膿皰型銀屑病及紅皮病型銀屑病,其中尋常型銀屑病為最常見的類型。因人種遺傳背景不同該病的人群患病率為0.1%～3%,中國漢族人發(fā)病率為0.123%。 銀屑病的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,已有研究表明：環(huán)境、遺傳因素和免疫炎癥反應(yīng)均在其發(fā)生和病理過程中起到十分重要的作用。通過全基因組掃描和連鎖分析至少已鑒定了9個銀屑病易感位點(diǎn)(PSORS1-9)。Filaggrin (FLG)是位于易感區(qū)間1q21的一個重要候選基因。FLG自發(fā)突變體小鼠(5303delA)皮損部位出現(xiàn)類似銀屑病的炎性特征,其他研究小組在銀屑病患者皮膚中檢測到filaggrin表達(dá)量和表達(dá)模式都發(fā)生了顯著變化,提示FLG可能與銀屑病的發(fā)生相關(guān)。為了證明FLG與銀屑病的相關(guān)性,研究小組分別在德國、愛爾蘭和英國人群銀屑病患者中開展的關(guān)聯(lián)研究,結(jié)果顯示FLG突變與銀屑病的發(fā)生無關(guān)。到目前為止,還沒有遺傳學(xué)證據(jù)表明FLG與銀屑病的發(fā)生有關(guān)。 本課題組許曉娟博士2009年采集到1個來自湖南岳陽的家系,這個家系的特點(diǎn)是銀屑病與魚鱗病患者共存：先證者表現(xiàn)為典型的銀屑病癥狀,而先證者的外婆和姑姑為魚鱗病患者。這個家系提示銀屑病與魚鱗病可能存在共同的發(fā)病機(jī)制。許曉娟隨后對這個特殊的銀屑病家系進(jìn)行了FLG突變研究,發(fā)現(xiàn)先證者攜帶FLG p.K4022X純合突變,而家系的魚鱗病患者攜帶p.K4022X雜合突變,這個結(jié)果提示我們p.K4022X的純合突變可能導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生。 本研究為了進(jìn)一步明確FLG與銀屑病易感性的關(guān)系,我們首先在441例患者和500個正常對照中針對p.K4022X進(jìn)行了突變檢測,結(jié)果檢測到了2例患者攜帶p.K4022X的純合改變,而在正常人中未發(fā)現(xiàn)純合改變,提示純合突變可能導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生。另外分別在29例患者(6.6%)和15個正常對照(3%)中檢測到了p.K4022X的雜合改變。隨后我們開展了p.K4022X病例-對照關(guān)聯(lián)研究,結(jié)果顯示p.K4022X在441例銀屑病患者和500個對照樣本間的基因型頻率和等位基因頻率比較的P值分別為0.011和0.002(p0.05),說明差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。同時相對危險度(OR)大于1,且95%可信區(qū)間下限大于1(OR=2.552(95%CI=1.377-4.731)),提示p.K4022X是中國人群銀屑病發(fā)生的危險因素。 其次,為了進(jìn)一步研究FLG突變與銀屑病的關(guān)系,我們分析了441例患者的整個FLG編碼區(qū)序列,發(fā)現(xiàn)了5個無義或移碼突變：一個未見報道的無義突變(p.W2583X)和4個在尋常型魚鱗病或特異性皮炎中報道過的突變(p.R826X, c.3321delA, p.Q2417X, c.7945delA)。 此外,我們在銀屑病患者中還鑒定了18個錯義突變。其中p.E2652D在2個銀屑�。~鱗病共存的家系中都鑒定到,2個家系中3個銀屑病患者均攜帶該純合突變,而2個魚鱗病患者和3個表型正常的個體攜帶該雜合變異,提示p.E2652D的純合突變可能導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生。 這些結(jié)果提示使FLG失去功能的純合突變導(dǎo)致銀屑病的可能性大。同時,純合的錯義突變也可能導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生。這是首次在遺傳學(xué)上證明了FLG與銀屑病的相關(guān)性,為中國人群銀屑病發(fā)生機(jī)制的深入研究奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：魚鱗病 filaggrin(FLG) 基因突變 銀屑病 filaggrin(FLG) 基因突變
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R758.52;R758.63;R394
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-13
• 目錄13-15
• 第一章 三個中國尋常型魚鱗病家系Filaggrin突變研究15-51
• 前言15-19
• 1. 研究對象19-21
• 2. 實(shí)驗(yàn)儀器及所用試劑、耗材21-23
• 2.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器21-22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材22-23
• 3 實(shí)驗(yàn)方法23-45
• 3.1 標(biāo)本采集23
• 3.2 外周血gDNA抽提23-24
• 3.3 gDNA原液的處理24-25
• 3.4 gDNA濃度標(biāo)準(zhǔn)化25
• 3.5 FLG引物設(shè)計與合成25-27
• 3.6 PCR擴(kuò)增27-35
• 3.7 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測35-37
• 3.8 測序37-38
• 3.9 疾病共分離研究38
• 3.10 TA克隆測序38-42
• 3.11. 連鎖分析42-44
• 3.12 正常人群篩查44-45
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-47
• 4.1 家系1突變篩查結(jié)果45
• 4.2 家系1疾病共分離研究結(jié)果45
• 4.3 TA克隆測序結(jié)果45-47
• 4.4 連鎖分析結(jié)果47
• 4.5 家系2和家系3突變篩查結(jié)果47
• 4.6 正常對照突變鑒定結(jié)果47
• 5 分析和討論47-50
• 6 結(jié)論50-51
• 第二章 中國人群尋常型銀屑病Filaggrin突變研究51-79
• 前言51-62
• 1 研究對象62-63
• 2 實(shí)驗(yàn)方法63-64
• 3 結(jié)果分析64-65
• 3.1 測序結(jié)果分析64
• 3.2 p.K4022X突變分析64
• 3.3 統(tǒng)計學(xué)分析64-65
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果65-74
• 4.1 p.K4022X測序結(jié)果65
• 4.2 p.K4022X統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果65-66
• 4.3 無義/移碼突變及統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果66-71
• 4.4 錯義突變71-72
• 4.5 p.R501X和c.2282de14在中國人群的突變研究結(jié)果72-73
• 4.6 基因芯片分型數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果73-74
• 5 分析和討論74-78
• 6 結(jié)論78-79
• 參考文獻(xiàn)79-87
• 綜述87-111
• 參考文獻(xiàn)102-111
• 攻讀學(xué)位期間主要的研究成果111-113
• 致謝113

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