本文關鍵詞：梅毒螺旋體鞘蛋白Tp0664經TLR2途徑誘導THP-1細胞表達IL-6

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【摘要】：目的:構建梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)重組鞘蛋白Tp0664的原核表達載體,在純化并鑒定表達產物后去除其中的內毒素,初步探討其誘導THP-1細胞產生促炎細胞因子IL-6的能力。此外,通過研究TLR2負顯性質粒、TLR4與TLR5干擾RNA、TLR6負顯性質粒、MyD88負顯性質粒、ERK特異性抑制劑PD98059、JNK特異性抑制劑SP600125、p38特異性抑制劑SB203580和NF-κB特異性抑制劑BAY11-7082對Tp0664誘導THP-1細胞產生IL-6的影響,探討其誘導THP-1細胞產生IL-6是否與TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、MyD88、ERK1/2、JNK、p38和NF-κB介導的信號轉導途經有關。方法:從GenBank獲取tp0664基因的完整序列,然后設計高特異性引物。提取Tp Nichols標準株DNA,以其為模板,PCR技術擴增tp0664全長基因;構建pET28a-Tp0664原核表達載體,經菌液PCR以及測序鑒定后,將其轉化至E.coli BL21(DE3)表達宿主菌中,IPTG誘導重組蛋白Tp0664的表達。采用SDS-PAGE和Western bloting對表達產物進行分析、鑒定;使用Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白,二喹啉甲酸法測定蛋白濃度;多黏菌素B去除Tp0664中的內毒素后使用鱟試劑測定Tp0664中內毒素含量;Tp0664刺激THP-1細胞,RT-PCR檢測IL-6 mRNA轉錄水平,ELISA雙抗體夾心法檢測IL-6表達水平,Western bloting檢測相關信號分子磷酸化水平。TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和MyD88負顯性質粒或干擾RNA轉染至THP-1細胞后,Tp0664刺激THP-1細胞,RT-PCR、ELISA和Western bloting分別檢測IL-6 mRNA轉錄水平、IL-6表達水平和相關信號分子的磷酸化水平。erk1/2特異性抑制劑pd98059、jnk特異性抑制劑sp600125、p38特異性抑制劑sb203580和nf-κb特異性抑制劑bay11-7082分別預處理thp-1細胞30min后,tp0664刺激thp-1細胞,rt-pcr、elisa和westernbloting分別檢測il-6mrna轉錄水平、il-6表達水平和相關信號分子的磷酸化水平。結果:成功構建pet28a-tp0664重組質粒,經菌液pcr和測序鑒定后證實插入片段為tp0664基因序列;e.colibl21表達菌在iptg誘導后表達相對分子量mr約為34kda的目的蛋白。經分析,tp0664為可溶性蛋白。ni-nta親和層析純化后十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳sds-page證實蛋白純度95%,mr與目的蛋白大小相符。westernbloting鑒定表明純化的重組蛋白即為目的蛋白。多黏菌素b處理tp0664后稀釋,鱟試劑測定該重組蛋白所含內毒素為0.036eu/ml;不同濃度tp0664(0.5μg/ml~10μg/ml)刺激thp-1細胞均能引起il-6mrna轉錄水平升高以及il-6表達水平升高,但1.0μg/ml刺激thp-1細胞24h時il-6mrna轉錄水平最高,1.0μg/ml刺激thp-1細胞48h時il-6表達水平最高。thp-1細胞轉染tlr2和myd88負顯性質粒后,il-6mrna轉錄水平和il-6表達水平明顯受抑。erk1/2特異性抑制劑pd98059、p38特異性抑制劑sb203580和nf-κb特異性抑制劑bay11-7082預處理thp-1細胞30min后,再以tp0664刺激thp-1細胞,il-6mrna轉錄水平和il-6表達水平明顯受抑,處理組與對照組比較(p0.05)有明顯差異。但是,jnk特異性抑制劑sp600125在預處理thp-1細胞30min后抑制tp0664誘導il-6mrna轉錄以及il-6表達的效果不佳,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。結論:(1)tp重組鞘蛋白tp0664可誘導thp-1細胞表達促炎細胞因子IL-6;(2)TLR2、MyD88、ERK1/2、p38和NF-κB參與重組蛋白Tp0664誘導THP-1細胞表達促炎細胞因子IL-6。
【關鍵詞】：梅毒螺旋體 重組蛋白 Tp0664 IL-6 信號轉導通路
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R759.1
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 主要縮略語英文索引12-14
• 第一章 前言14-18
• 第二章 實驗材料18-22
• 1. 實驗動物18
• 2. 菌株和質粒18
• 3. 主要儀器設備18-19
• 4. 主要實驗試劑及試劑盒19-22
• 第三章 實驗方法22-38
• 1. TpDNA提取22
• 2. tp0664全基因序列擴增22-23
• 3. pET28a-Tp0664原核表達載體的構建與鑒定23-26
• 4. Tp0664重組蛋白的表達與鑒定26-27
• 5. 重組蛋白Tp0664的Western bloting鑒定27-28
• 6. 重組蛋白Tp0664純化以及濃度測定28-29
• 7. 重組蛋白Tp0664免疫新西蘭兔后檢測抗體效價29-30
• 8. 重組蛋白Tp0664去除內毒素后的內毒素濃度測定30-31
• 9. THP-1 細胞培養(yǎng)31
• 10. 重組蛋白Tp0664刺激實驗31
• 11. Western bloting檢測蛋白表達以及激酶磷酸化水平31-32
• 12. 瞬時轉染與RNA干擾32-33
• 13. DN-TLR2、DN-TLR6和DN-MyD88擴增與轉染33-34
• 14. RT-PCR檢測IL-6 mRNA轉錄34-36
• 15. ELISA檢測IL-6 分泌36
• 16. MAPKs和NF-κB抑制劑下調Tp0664誘導THP-1 細胞分泌IL-636-37
• 17. 免疫熒光檢測p65核轉位37
• 18. 統(tǒng)計學分析37-38
• 第四章 實驗結果38-60
• 1. tp0664基因的PCR擴增38
• 2. pET28a-Tp0664原核表達載體的PCR鑒定38
• 3. pET28a-Tp0664重組質粒的測序鑒定38-39
• 4. pET28a-Tp0664重組質粒誘導表達條件的優(yōu)化39-41
• 5. His-tagged Tp0664蛋白的表達與純化41-42
• 6. 重組蛋白Tp0664的Western bloting鑒定42
• 7. 重組蛋白Tp0664濃度測定42-43
• 8. ELISA檢測重組蛋白Tp0664免疫后的兔血清抗體效價43
• 9. 重組蛋白Tp0664內毒素的測定43-44
• 10. 重組蛋白Tp0664刺激THP-1 細胞后mRNA完整性鑒定44-45
• 11. 重組蛋白Tp0664誘導THP-1 細胞表達IL-6 mRNA45-47
• 12. 重組蛋白Tp0664誘導THP-1 細胞分泌IL-647
• 13. Tp0664誘導THP-1 細胞活化ERK1/2、p38和NF-κB47-49
• 14. ERK1/2、p38和NF-κB特異性抑制劑抑制Tp0664誘導THP-1細胞分泌IL-649-53
• 15. ERK1/2、p38和NF-κB特異性抑制劑抑制Tp0664誘導其磷酸化53-54
• 16. DN-MyD88阻斷Tp0664誘導THP-1 細胞分泌IL-654-55
• 17. DN-TLR2阻斷Tp0664誘導THP-1 細胞分泌IL-655-56
• 18. DN-TLR2抑制THP-1 細胞ERK1/2、p38和NF-κB磷酸化56-57
• 19. NF-κB抑制劑BAY11-7082抑制THP-1 細胞p65核轉位57-60
• 第五章 討論60-64
• 第六章 結論64-66
• 參考文獻66-72
• 文獻綜述72-80
• 參考文獻76-80
• 碩士期間科研成果80-82
• 資助項目82-83
• 致謝83

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前3條

1 謝亞鋒;蔣傳好;吳移謀;;梅毒螺旋體遺傳物質和致病機制的研究進展[J];微生物學免疫學進展;2014年03期

2 ;Production of proinflammatory cytokines in the human THP-1 monocyte cell line following induction by Tp0751,a recombinant protein of Treponema pallidum[J];Science China(Life Sciences);2010年02期

3 韓國柱,邵長庚;我國梅毒流行和臨床特點[J];中華皮膚科雜志;2005年05期

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本文編號：1058779