本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子SOX5通過調(diào)控MMP9基因表達影響類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞遷移和侵襲的研究

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【摘要】：實驗目的：既往認為轉(zhuǎn)錄因子SOX5主要參與胚胎發(fā)育、細胞周期及軟骨形成的調(diào)控,而在類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis, RA)中的作用尚未見報道。我們前期在RANKL基因啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)一個RA新的易感位點,該位點突變后形成轉(zhuǎn)錄因子SOX5結(jié)合位點。隨后,我們原創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)SOX5在RA滑膜組織中高表達,能調(diào)控滑膜成纖維細胞(Synovial Fibroblasts, SFs)中RANKL高表達,參與RA骨侵蝕。類似于腫瘤細胞的遷移與侵襲性是RA SFs的重要特征,本研究主要探討SOX5對RA SFs遷移和侵襲特性的影響及其可能的機制。實驗方法：1.轉(zhuǎn)錄因子SOX5對RA SFs遷移及侵襲能力的影響(1)構(gòu)建低表達SOX5慢病毒載體轉(zhuǎn)染成纖維細胞,沉默RA SFs中SOX5的表達,采用Transwell小室遷移實驗、劃痕試驗、Transwell小室加基質(zhì)膠侵襲實驗檢測沉默S OX5后對RA SFs遷移及侵襲的影響；(2)鬼筆環(huán)肽染色探究沉默SOX5對細胞微絲骨架的影響。2.轉(zhuǎn)錄因子SOX5調(diào)節(jié)RA SFs遷移及侵襲機制的研究(1)分別使用SOX5低表達慢病毒載體及重組腺病毒SOX5高表達載體轉(zhuǎn)染RA SFs的細胞系MH7A, Real-time PCR及Western blot檢測高表達／低表達SOX5后對MH7A中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達的影響；(2)將重組MMP9因子加入低表達SOX5的RA SFs中,經(jīng)Transwell小室遷移實驗、劃痕試驗、Transwell小室加基質(zhì)膠侵襲實驗評估外源性補充MMP9是否可以逆轉(zhuǎn)沉默SOX5對細胞遷移及侵襲的抑制作用。3.轉(zhuǎn)錄因子SOX5調(diào)控MMP9表達機制的研究(1)在MH7A中過表達SOX5后,采用ChIP實驗檢測SOX5是否能與MMP9啟動子區(qū)相結(jié)合。(2)構(gòu)建MP9啟動子熒光素酶報告載體,觀察過表達SOX5對MP9啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響。(3)采用Real time-PCR法檢測低表達、高表達SOX5后,MH7A中與MMP9相關(guān)miRNA的變化；使用miR-15a、16 mimics轉(zhuǎn)染高表達SOX5后的MH7A,反向驗證miR-15a、16在SOX5間接調(diào)節(jié)MMP9中的作用及對MH7A遷移性的影響。4.關(guān)節(jié)局部沉默Sox5對膠原誘導關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜侵襲性和Mmp9表達的影響建立膠原誘導關(guān)節(jié)炎小鼠模型(CIA),局部關(guān)節(jié)注射siRNA-Sox5低表達病毒,Real time-PCR、免疫組化檢測關(guān)節(jié)組織中MMP9的表達；組織病理學觀察沉默SOX5對滑膜侵蝕軟骨的影響。實驗結(jié)果：1.轉(zhuǎn)錄因子SOX5對RA SFs遷移及侵襲能力的影響在RA SFs中低表達SOX5后,與陰性對照病毒組相比,細胞遷移性和侵襲性顯著降低(p0.001),細胞中微絲骨架的重排也明顯減弱。2.轉(zhuǎn)錄因子SOX5調(diào)節(jié)RA SFs遷移及侵襲機制的研究在與RA SFs遷移與侵襲相關(guān)的MMPs家族中,沉默SOX5能顯著抑制MMP2、MMP9表達,其中對MMP9的影響最明顯,而對MMP12、MMP3的表達無明顯影響；過表達SOX5能顯著增強MMP9的表達；外源性加入重組MMP9可部分逆轉(zhuǎn)沉默SOX5對ROSFs遷移及侵襲的抑制作用。3.轉(zhuǎn)錄因子SOX5調(diào)控MMP9表達機制的研究ChIP結(jié)果顯示,在MH7A中高表達SOX5可增加SOX5與MMP9啟動子區(qū)的結(jié)合；螢光素酶報告基因結(jié)果顯示,在MH7A中高表達SOX5可增強MMP9啟動子的轉(zhuǎn)錄活性；低表達SOX5可以增高MH7A中miR-15a、miR-16的表達,而高表達SOX5可以抑制miR-15a 、miR-16的表達；niR-15a mimics可以抑制高表達SOX5對MH7A中MMP9的誘導作用,抑制MH7A的遷移性。miR-16mimics可以抑制高表達SOX5對MH7 A中MMP9的誘導作用,但對MH7A的遷移性無明顯作用。4.關(guān)節(jié)局部沉默Sox5對膠原誘導關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠滑膜侵襲性和Mmp9表達的影響在CIA小鼠關(guān)節(jié)局部沉默Sox5后,關(guān)節(jié)組織中Sox5及Mmp9的表達明顯減低；HE結(jié)果顯示低表達Sox5組CIA鼠膝關(guān)節(jié)滑膜對軟骨的侵蝕作用明顯減輕。實驗結(jié)論：1.轉(zhuǎn)錄因子SOX5可通過調(diào)控RASFs中MMP9的表達影響滑膜成纖維細胞的遷移和侵襲能力。2.SOX5可能通過兩方面機制調(diào)控MMP9表達：SOX5直接與MMP9啟動子區(qū)結(jié)合,調(diào)控MMP9的轉(zhuǎn)錄；SOX5通過對miR-15a的調(diào)控間接影響MMP9的表達。3.CIA鼠關(guān)節(jié)局部沉默Sox5能顯著抑制關(guān)節(jié)組織中Mmp9的表達,改善滑膜對關(guān)節(jié)及軟骨的侵蝕作用。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)錄因子SOX5 類風濕關(guān)節(jié)炎 滑膜成纖維細胞 遷移與侵襲 基質(zhì)金屬蛋白酶9
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R593.22
【目錄】：

• 中英文縮略對照詞表6-7
• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-13
• 前言13-17
• 參考文獻15-17
• 第一部分 轉(zhuǎn)錄因子SOX5對類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞遷移及侵襲能力的影響17-29
• 引言17-18
• 材料與方法18-23
• 實驗結(jié)果23-26
• 討論26-27
• 結(jié)論27-28
• 參考文獻28-29
• 第二部分 轉(zhuǎn)錄因子SOX5調(diào)節(jié)類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞遷移及侵襲機制的研究29-45
• 前言29-30
• 材料和方法30-39
• 實驗結(jié)果39-42
• 討論42-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻44-45
• 第三部分 轉(zhuǎn)錄因子SOX5調(diào)節(jié)RASFS表達MMP9機制的研究45-58
• 引言45-46
• 材料與方法46-51
• 實驗結(jié)果51-55
• 討論55-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻57-58
• 第四部分 關(guān)節(jié)局部沉默SOX5對膠原誘導關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜侵襲性和MMP9表達的影響58-69
• 引言58-59
• 材料與方法59-64
• 實驗結(jié)果64-66
• 討論66-67
• 結(jié)論67-68
• 參考文獻68-69
• 實驗小結(jié)69-71
• 綜述71-81
• 參考文獻77-81
• 致謝81-82

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 章平衡;劉健;談冰;朱福兵;方利;;類風濕性關(guān)節(jié)炎患者高凝血狀態(tài)與核因子κB活化及致炎因子增加有關(guān)[J];細胞與分子免疫學雜志;2016年03期

2 王亞媛;高薇;王燕;馮欣;;RNA干擾沉默信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3對類風濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞增殖的影響[J];中國全科醫(yī)學;2013年36期

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本文編號：986549